CRISPR) on kolmannen sukupolven genominmuokkaustekniikka: CRISPR mullisti maailman

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) on kolmannen sukupolven genominmuokkaustekniikka, joka on mullistanut maailman korkean läpimenon tuloksillaan. Sitä on käytetty erilaisten biologisten sairauksien ja infektioiden hoitoon. Myös useilla bakteereilla ja muilla prokaryooteilla (kuten arkeoneilla) on CRISPR/Cas9-järjestelmiä puolustautumaan faageja vastaan. On raportoitu, että CRISPR/Cas9-pohjaiset strategiat voivat estää kolmoisnegatiivisen rintasyövän (TNBC) kasvua ja etenemistä kohdistamalla mahdollisesti muuttuneisiin resistenssigeeneihin, transkriptioon ja epigeneettiseen säätelyyn. Nämä terapeuttiset interventiot voivat auttaa ratkaisemaan haastavia ongelmia, kuten lääkeresistenssiä, jota havaitaan jopa TNBC:ssä. Tällä hetkellä CRISPR/Cas9:n toimittamiseen kohdesoluihin käytetään erilaisia ​​menetelmiä, kuten fysikaalisia (mikroinjektio, elektroporaatio ja hydrodynaamiset menetelmät), viraalisia (adeno-associated virus ja lentivirus) ja ei-viraalisia (liposomit ja lipidinanohiukkaset). Vaikka TNBC:n molekyylisyiden tutkimiseksi on kehitetty erilaisia ​​malleja, herkkien ja kohdennettujen menetelmien puute genominmuokkaustyökalujen toimittamiseksi in vivo rajoittaa niiden kliinistä soveltamista. Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä katsauksessa tarkastellaan kattavasti CRISPR/Cas9-hoidon edistymistä, haasteita, rajoituksia ja tulevaisuudennäkymiä TNBC:n hoidossa olemassa olevan näytön perusteella. Korostamme myös, miten tekoälyn ja koneoppimisen yhdistelmä voi parantaa CRISPR/Cas9-strategioita TNBC:n hoidossa.
Syövälle on ominaista hallitsematon solunjakautuminen, solusyklin tarkastuspisteiden häiriintyminen ja kasvainsuppressorigeenien (TSG) mutaatiot (Matthews et al., 2022). Erilaisista syöpätyypeistä rintasyöpä on yleisin syöpätyyppi naisilla ja sillä on korkea kuolleisuus maailmanlaajuisesti (Waks ja Winer, 2019). Rintasyöpä on heterogeeninen sairaus, jolla on erilaisia ​​ominaisuuksia, kuten histologiset ja biologiset piirteet, kliininen esittely ja käyttäytyminen sekä hoitovaste (Weigelt et al., 2010). Rintasyövän luokittelu antaa tarkkoja tietoja rintasyövän diagnosointiin ja kasvaimen ennusteeseen. Yhteisten biomarkkereiden ja kliinis-patologisten piirteiden käyttö on ollut tärkein kriteeri rintasyövän luokittelussa (Tsang ja Tse, 2019). Rintasyövän ennusteeseen ja hoitovasteeseen vaikuttavat lukuisat tekijät, mukaan lukien estrogeenireseptorin (ER), progesteronireseptorin (PR), ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin 2 (HER2/neu) läsnäolo sekä histologinen aste, kasvaimen tyyppi ja koko sekä imusolmukkeiden etäpesäkkeet (Al-Tubaiti, 2020). Rintasyövästä on tunnistettu viisi luontaista molekyylialatyyppiä, mukaan lukien luminaalinen A, luminaalinen B, HER2-rikastettu, basaalin kaltainen ja klaudiiniton (Prat et al., 2015). TNBC on syövän molekyylialatyyppi, joka ei ilmennä kaikkia ER-, PR- ja HER2-proteiineja (Yin et al., 2020). Nämä patologiset piirteet liittyvät TNBC:hen, mikä vahvistaa sen nopean etenemisen ja aggressiivisemman luonteen kuin mikään muu rintasyöpätyyppi (Feng et al., 2018). Lisäksi Peru et al. (2000) käyttivät mikrosiruteknologiaa rintasyövän uudelleenluokittelemiseen ja viiden rintasyövän luontaisen alatyypin tunnistamiseen (Cadenas, 2012). Basaalin kaltainen rintasyöpä on rintasyövän alatyyppi, jolla on kolmoisnegatiivinen fenotyyppi ja johon liittyy nopea eteneminen. On huomattava, että kaikki basaalin kaltaiset rintasyövät diagnosoidaan usein väärin TNBC:ksi, mutta vain 77 % on TNBC:tä; Sitä vastoin 71–91 % TNBC:istä on basaalin kaltaisia, mikä osoittaa, että nämä kaksi rintasyöpätyyppiä ovat päällekkäisiä ja edustavat eri luokituksia (Wang D.-Y. ym., 2019). Tämä luo tarpeen karakterisoida TNBC:n heterogeenisyyttä ennusteen selvittämiseksi ja mahdollisten vasteiden tunnistamiseksi nykyisille ja tuleville hoidoille. Lisäksi TNBC muodostaa 15–20 % kaikista rintasyöpätapauksista ja on yleisempi alle 50-vuotiailla naisilla. BRCA1- tai BRCA2-mutaatioita on raportoitu noin 20 %:lla TNBC-tapauksista (Xie ym., 2017; Tzikas ym., 2017). Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että TNBC:llä on selkeä immuunimikroympäristö, joka sisältää runsaasti verisuonten endoteelikasvutekijöitä, kasvaimeen liittyviä makrofageja (TAM), kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) ja muita kasvaimen kasvuun ja migraatioon osallistuvia molekyylejä. Siksi TNBC:n mikroympäristön ymmärtäminen on kriittistä sen ennusteen ja hoidon kannalta (Fan ja He, 2022).
TNBC:n ennusteen arvioimiseksi ja tehokkaan hoidon varmistamiseksi on tärkeää tarkka diagnoosi, joka perustuu pääasiassa immunohistokemiaan (IHC) ER:n, PR:n ja HER2:n havaitsemiseksi sekä mammografiaan rintasyöpäkasvainten havaitsemiseksi. Mammografia ei kuitenkaan pysty riittävästi kuvaamaan kasvaimen sisäisiä ominaisuuksia, kuten nekroosia ja fibroosia (Deepak Singh et al., 2021). Koska huono ennuste ja diagnoosi estävät lääkäreitä määräämästä oikeita lääkkeitä (Chaudhary, 2020), TNBC-potilaiden hoidon parantamiseksi käytetään erilaisia ​​strategioita. Tällä hetkellä TNBC-potilailla käytetään kahta lääkettä, doksorubisiinia ja syklofosfamidia, ja niillä on osoitettu hyviä tuloksia. Lisäksi käytetään muita platinalääkkeitä, kuten karboplatiinia ja sisplatiinia (Sikov et al., 2015). PARP-estäjiä, kuten Olaparibia, Velaparibia ja PF-01367338:aa, on käytetty potentiaalisina solunsalpaajina TNBC:n hoidossa (Ishino et al., 2018). Koska Wnt/b-kateniinin, NOTCH:n ja Hedgehog-signalointireittien on raportoitu olevan osallisina TNBC:n esiintymisessä ja etenemisessä, lääkkeiden kohdentaminen näihin reitteihin voi olla tärkeä strategia (Aysola et al., 2013). Vaikka leikkaus, sädehoito ja kemoterapia ovat edelleen TNBC:n hoidon perusta, uusien hoitojen kehittämisessä on edistytty merkittävästi, mukaan lukien kohdennettu terapia, immunoterapia, erilaiset CRISPR:ään liittyvät geeninmuokkaustyökalut, kuten Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing ja CRISPR/Cas9-kohdennettu geeniterapia. Tässä keskitymme erilaisiin CRISPR:ään liittyviin geeninmuokkaustyökaluihin, joita käytetään TNBC:n hoidossa. Niistä CRISPR/Cas9 on saanut laajaa huomiota.
Cas9n, joka tunnetaan myös nimellä Cas9-nikaasi, on geneettisesti muunneltu Cas9-proteiinin variantti, joka on johdettu CRISPR/Cas9-genominmuokkausjärjestelmästä (Gupta et al., 2019). Alkuperäisessä muodossaan Cas9-proteiini sisältää kaksi nukleaasidomeenia: RuvC:n ja HNH:n, joiden päätehtävänä on molempien DNA-säikeiden pilkkominen. Cas9n:ssä toinen nukleaasidomeeneista, HNH, on kuitenkin geneettisesti mutatoitunut ja muuttuu inaktiiviseksi. Siksi Cas9n:n HNH-domeeni pysyy toimimattomana. Vain RuvC-domeeni pysyy aktiivisena, jolloin Cas9n voi leikata tai luoda katkoksia yksittäisiin DNA-säikeisiin (Trevino ja Zhang, 2014). Cas9:ään verrattuna Cas9n voi tehokkaasti vähentää kohteen ulkopuolisia vaikutuksia ja parantaa tarkasti solujen korjausmekanismeja. Cas9n:ää voidaan käyttää erilaisten ongelmien ratkaisemiseen, kuten katkosten luomiseen tiettyihin paikkoihin kaksijuosteisessa DNA:ssa. Tätä tarkoitusta varten yhdistettiin kaksi Cas9n-molekyyliä ja niitä käytettiin yhdessä (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) on mitogeenin aktivoima proteiinikinaasi, joka toimii keskeisenä säätelijänä TNBC-metastaasien aikana (Cronan et al., 2012).
MLK3 voi aktivoida useita signalointireittejä, jotka johtavat TNBC-metastaasiin. Esimerkiksi c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) -reitti säätelee solujen liikkuvuutta ja solunulkoisen matriisin hajoamista, ja MLK3 aktivoi JNK-reitin, mikä parantaa solujen liikkuvuutta ja antaa invasiivisia ominaisuuksia (Rattanasinchai ja Gallo, 2016). MLK3 säätelee myös EMT:tä. Tätä varten se aktivoi alavirran transkriptiotekijöitä, kuten Snail, Slug ja Twist. Nämä tekijät estävät epiteelimerkkiaineiden ilmentymistä ja edistävät mesenkymaalisten markkereiden ilmentymistä, mikä johtaa metastaattisen fenotyypin muodostumiseen (Casalino et al., 2023). MLK3:n on havaittu osallistuvan ECM:n uudelleenmuodostukseen ja proteaasien, kuten matriksin metalloproteinaasien (MMP), aktivoitumiseen, jotka hajottavat ECM:ää. Tämä helpottaa kasvainsolujen invaasiota ja leviämistä kaukaisiin kohtiin (Katari et al., 2019). Aiemmat tutkimukset ovat siis osoittaneet, että MLK3:lla on kriittinen rooli TNBC:ssä. Rattanasinchai ja Gallo käyttivät TNBC-malleja tutkiakseen MLK3:n roolia ja havaitsivat, että se edistää syövän kehittymistä tiettyjen signalointireittien kautta. He käyttivät CRISPR/Cas9n:ää MLK3:n muokkaamiseen ja havaitsivat merkittävän TNBC-metastaasien vähenemisen (Rattanasinchai ja Gallo, 2016).
dCas9, jota usein kutsutaan inaktiiviseksi Cas9:ksi, on Cas9-proteiinin muunneltu johdannainen. Toisin kuin aktiiviselta Cas9:ltä, dCas9:ltä puuttuu endonukleaasiaktiivisuus, minkä vuoksi se ei pysty indusoimaan DNA:n kaksoisjuostekatkoksia. Siksi dCas9:ää voidaan käyttää genomin tiettyjen alueiden tarkkaan kohdentamiseen ilman DNA-sekvenssin muutoksia tai modifikaatioita (Wang et al., 2016). dCas9:ssä kaksi endonukleaasiproteiinia, RuvC ja HNH, inaktivoituvat tukahduttamalla tärkeitä aminohappotähteitä. (Richter et al., 2016). Huolimatta DNA:n pilkkomisaktiivisuuden puutteesta, dCas9:llä on useita tärkeitä rooleja geneettisessä tutkimuksessa ja bioteknologiassa. Se esimerkiksi mahdollistaa genomin tiettyjen alueiden visualisoinnin, helpottaa transkription säätelyä ja edistää epigeneettisiä modifikaatioita (Brocken et al., 2018).
Transkriptiotekijä ZEB1 (sinkkisormen E-boxin sitoutumismekanismia aktivoiva homeoboksi 1) on spesifinen ja kriittinen rooli epiteeli-mesenkymaali-transition (EMT) välittämisessä. EMT on soluprosessi, jota tapahtuu alkionkehityksen, kudosten korjautumisen ja syövän etenemisen aikana. Se sisältää epiteelisolujen muuttumisen mesenkymaalisoluiksi, mikä johtaa muutoksiin solujen morfologiassa, liikkuvuudessa, invasiivisuudessa jne. (Wu et al., 2020). ZEB1 estää useita epiteelisolujen markkereita, kuten E-kadheriinia ja okkludiinia, jotka vastaavat epiteelisolujen soluvälisen adheesion ja polaarisuuden ylläpidosta TNBC:ssä (Moreno-Bueno et al., 2008). Lisäksi ZEB1 aktivoi tiettyjä markkereita, kuten N-kadheriinia, vimentiiniä ja fibronektiiniä (Konradi et al., 2014), ja säätelee myös sytoskeleton uudelleenmuotoutumiseen osallistuvia geenejä, kuten Rho GTPaaseja ja matriksin metalloproteinaaseja (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), lisäksi se vaikuttaa myös useisiin signalointireitteihin, kuten transformoivaan kasvutekijä-β:aan (TGF-β), Wnt-signalointiin jne., edistäen siten kasvaimen invaasiota ja metastaasia TNBC:ssä (Chen et al., 2016). Lukuisat tutkimukset ja tieteellinen näyttö osoittavat, että ZEB1:llä on suuri potentiaali arvokkaana aineena TNBC:n havaitsemisessa ja terapeuttisessa interventiossa. Äskettäisessä tutkimuksessa Waryah et al. käyttivät TNBC-mallia ja saavuttivat ZEB1:n täydellisen suppression dCas9:llä. Siten he havaitsivat erittäin korkean spesifisyyden ja lähes täydellisen ZEB1:n eston in vivo -olosuhteissa (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 on geenienmuokkaustyökalu nimeltä CRISPR/Cpf1. Se on johdettu CRISPR/Cas-järjestelmästä, jossa termi Cas12 viittaa CRISPR:ään liittyvään proteiiniin 12 (Bharathkumar et al., 2022), joka on täysin samanlainen kuin Cas9. Ainoa ero on, että se sisältää Cas12-proteiinin. Cas9:ään verrattuna Cas12:lla on joitakin ainutlaatuisia toimintoja, kuten tahmeiden päiden luominen geenienmuokkausprosessin aikana, kun taas Cas9 luo tylppiä päitä (Wang et al., 2021). Tämä Cas12:n ominaisuus edistää sen spesifistä DNA:n manipulointiteknologiaa. Proteiinina, joka kykenee tunnistamaan ja leikkaamaan kohde-DNA:ta tarkasti, sillä on poikkeuksellisen paljon monipuolisuutta, mikä tekee siitä tehokkaan työkalun moniin sovelluksiin, mukaan lukien geenien muokkaamiseen (Pickar-Oliver ja Gersbach, 2019).
Kuten muutkin CRISPR-variantit, CRISPR/Cas12 pystyy myös poistamaan tai aktivoimaan geenejä TNBC:ssä, kohdistaen vaikutukset geeneihin, joilla on tärkeä rooli sen patogeneesissä tai hoitovasteessa (Yang ja Zhang, 2023). Tämän prosessin toteuttamiseksi kehitettiin ohjaus-RNA (gRNA), joka ohjaa Cas12:n kohdegeeniin. Kun Cas12 sitoutuu kohteeseensa, se aiheuttaa kaksoisjuostekatkoksia DNA:han ja aktivoi DNA:n korjausmekanismeja. Korjausprosessin aikana virheellisiä nukleotideja voi liittyä, mikä johtaa geenimutaatioihin ja toiminnan menetykseen (Zhang et al., 2021a). Lisäksi Cas12-entsyymin parannettua versiota (nimeltään dCas12) käytettiin myös geenien aktivoimiseen. Yhdistämällä se transkriptioaktivaattoriin on mahdollista indusoida tiettyjä geenejä ja siten aktivoida ne. Tällä teknologialla on suuri potentiaali kasvaimen suppressorigeenien aktivaation edistämisessä (Sultan et al., 2022).
Prime editing on äskettäin kehitetty ja erittäin ylivoimainen genominmuokkaustekniikka. Se pystyy muokkaamaan organismin DNA:ta erittäin tarkasti (Chen ja Liu, 2023). Prime editing saavutetaan integroimalla kaksi pääkomponenttia: modifioitu CRISPR/Cas9-entsyymi ja käänteiskopioijaentsyymi. CRISPR/Cas9-entsyymin tehtävänä on kohdistaa vaikutuksia valikoivasti genomin tarkkoihin kohtiin, kun taas käänteiskopioijaentsyymi auttaa muokkaamaan DNA:ta perusteellisesti kohdepaikassa (Hassan et al., 2021). Primerinmuokkausmekanismissa ensimmäisessä vaiheessa luodaan primerinmuokkausta ohjaava RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Se sisältää kohdesekvenssin ja RNA-templaatin, joka vastaa haluttua muokkauskohtaa kohde-DNA:ssa. PegRNA viedään sitten kohdesoluihin yhdessä primerinmuokkausnukleaasin (PE2) kanssa. PE2 on fuusioproteiini, joka koostuu Cas9-entsyymistä, käänteiskopioijaentsyymistä ja primerinmuokkaussovittimesta (Martín-Alonso et al., 2021). Solun sisällä pegRNA- ja PE2-kompleksit etsivät spesifistä DNA:ta, jota ne haluavat muokata. Cas9-entsyymi katkaisee DNA:n ja luo templaatin, joka koostuu yksittäisistä juosteista (Choi et al., 2022). Käänteiskopioijaentsyymi käyttää tätä templaattia DNA:n valmisteluun muokkausta varten. DNA:n kopioinnin lisäksi mukana on myös ohjeet RNA-templaatin muokkaamiseksi. Lopuksi uutta DNA-juostetta käytetään templaattina DNA:n katkoksen korjaamiseksi, jolloin tuloksena on muuttunut DNA-sekvenssi, joka sisältää halutun modifikaation (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Alukemuokkausmekanismit voivat johtaa laajalle levinneisiin mutaatioihin geeneissä. Se voi kohdistaa pistemutaatioihin, insertioihin, deleetioihin ja jopa geenien korvautumisiin (Anzalone et al., 2019; Chen ja Liu, 2023). Alukemuokkaus tarjoaa useita etuja aiempiin genominmuokkaustekniikoihin verrattuna. Näitä ovat lisääntynyt tarkkuus, vähentyneet kohteen ulkopuoliset vaikutukset ja kyky muokata DNA:ta ilman, että tarvitaan DNA:n kaksoisjuostekatkoksia (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9-teknologia kehitettiin alun perin suojaamaan bakteereja plasmidisiirroilta ja faagi-infektioilta, ja myöhemmin sitä käytettiin uudelleen tehokkaana RNA-pohjaisena DNA:n kohdentamistyökaluna genomin muokkaamiseen (Jiang ja Doudna, 2017). Lisäksi CRISPR/Cas9-järjestelmän on raportoitu olevan läsnä 50 %:ssa bakteerien ja 87 %:ssa arkeonien genomeista (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 on potentiaalinen työkalu minkä tahansa epänormaalin geneettisen sekvenssin deleetioon, insertioon ja korjaamiseen in vivo- ja in vitro -menetelmillä (Sabit et al., 2021). Lisäksi CRISPR/Cas9:n on osoitettu olevan osa adaptiivista immuunijärjestelmää, koska se on spesifinen kiinnostuksen kohteena oleville kohdegeeneille (Chen ja Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 koostuu Cas9:stä ja yhdestä ohjaus-RNA:sta (sgRNA). Cas9 on endonukleaasi, joka koostuu useista proteiinikomponenteista. Lisäksi Cas9:llä on ainutlaatuisia rakenteellisia ja konformaatioon liittyviä ominaisuuksia (Pacesa et al., 2022), koska se koostuu kahdesta lohkosta: tunnistuslohkosta (REC) ja nukleaasilohkosta (NUC). REC-lohko on jaettu edelleen kolmeen alueeseen: REC1, REC2 ja siltaheliksit (Cromwell et al., 2018). NUC koostuu kolmesta lohkosta: RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH ja protospacer-viereisen motiivin (PAM) vuorovaikutusdomeeni (kuva 1) (Song et al., 2016). sgRNA koostuu kahdesta komponentista, mukaan lukien CRISPR-RNA (crRNA) ja transkoodava pieni RNA (merkkiaine-RNA) (kuva 1). sgRNA yhdistää Cas9-proteiinin konneksiineihin muodostaen aktiivisen kompleksin, joka tunnetaan myös efektorikompleksina (Richter et al., 2012). crRNA on 18–20 nukleotidin emäspari, jolla on kriittinen rooli kohde-DNA-sekvenssien tunnistamisessa. Lisäksi crRNA pariutuu kohde-DNA:n kanssa, ja tracrRNA toimii Cas9-nukleaasin tukirakenteena kohde-DNA:han sitoutumisessa (Manghwar et al., 2019). Toisaalta PAM-sekvenssissä on kolme nukleotidia, mikä vahvistaa, määrittää ja välittää efektorikompleksin sitoutumista DNA:han. Cas9-proteiinikompleksin alayksiköillä RuvC ja HNH on katalyyttistä aktiivisuutta (Richter et al., 2012; Asmamaw ja Zawdie, 2021). Cas9-alayksikön HNH-nukleaasidomeeni katkaisee crRNA:han liittyvän DNA-juosteen. RuvC-nukleaasidomeeni katkaisee muita DNA-säikeitä ja aiheuttaa kaksoisjuostekatkoksia (DSB), minkä jälkeen aktivoituu kaksi erilaista DNA-katkosten korjausmekanismia (Jiang ja Doudna, 2017) (kuva 1).
Kuva 1. Yleiskatsaus CRISPR/Cas9:stä (A). CRISPR/Cas9-järjestelmän komponentit: (i). Cas9-endonukleaasi vastaa kohde-DNA-sekvenssin katkaisemisesta, (ii) yksittäinen ohjaus-RNA (sg), joka syntyy crRNA- ja tra-crRNA-kimeerojen fuusiosta. (kaksi). Cas9 sisältää useita komponentteja, kuten Rec I:n, Rec II:n, NUC-lohkon (HNH ja Ruv C ovat alikomponentteja) ja PAM-vuorovaikutusdomeenin (C) vastaavine toimintoineen. CRISPR/Cas9-proteiinikompleksi katkaisee DNA-sekvenssejä ei-komplementaarisiin ja komplementaarisiin muotoihin (D). CRISPR/Cas9 muokkaa genomia kolmessa vaiheessa: tunnistus, katkaisu ja korjaus. Suunniteltu sg-RNA ohjaa Cas9:ää ja tunnistaa halutun sekvenssin komplementaarisen crRNA-komponentin kautta. Cas9 tunnistaa PAM-sekvenssin 5′-NGG-3′:ssä ja sulattaa DNA:n muodostaen DNA-RNA-hybridin ja aktivoiden katkaisun. Cas9:n HNH-domeeni katkaisee komplementaarisen juosteen ja RuvC-domeeni katkaisee ei-komplementaarisen juosteen. CRISPR/Cas9 korjaa kaksijuosteisen DNA:n katkaisemalla sen kahdella tavalla: ei-homologisella päiden liittämisellä (NHEJ) ja homologiaohjatulla korjauksella (HDR). NHEJ korjaa kaksijuosteisen DNA:n vieraan homologisen DNA:n puuttuessa entsymaattisen prosessin avulla. Tämä virhealtis mekanismi voi lisätä tai poistaa satunnaisia ​​DNA-sekvenssejä. HDR on hyvin spesifinen ja vaatii homologisia DNA-templaatteja.
CRISPR/Cas9-välitteisiin korjausreitteihin kuuluvat ei-homologiset päiden liitosmekanismit (NHEJ) ja homologiaohjatut korjausmekanismit (HDR). NHEJ on virhealtis reitti, koska se sisältää insertion tai deleetion eikä vaadi mitään kaavaa korjausmekanismin aikana. Se käyttää satunnaisia ​​nukleotideja standardiproteiinien luomiseen (Abbasi et al., 2021). Tämä korjausjärjestelmä koostuu neljästä kompleksista, kuten KU-kompleksista, ristiinkomplementoivasta proteiinikompleksi tyypistä 4 (XRCC-4), DNA:n pään prosessointientsyymistä ja proteiinikinaasi DNA-PKcs:stä (Abbasi et al., 2021). KU-kompleksiproteiinilla on kaksi alayksikköä, Ku 70 ja Ku 80, ja sillä on tärkeä rooli NHEJ-mekanismissa, koska korjausmekanismi käynnistyy kahden alayksikön (Ku 70 ja Ku 80) sitoutuessa kohde-DNA:n tylppiin tai lähes tylppiin päihin (Abbasi et al., 2021), mikä toimii tukirakenteina muiden NHEJ:hen liittyvien tekijöiden rekrytoimiseksi vauriokohtaan (Yang et al., 2020). XRCC-4 ja DNA-ligaasi koostuvat vastaavasti 334 ja 911 aminohaposta, ja XRCC4-DNA-ligaasi IV -kompleksi stimuloi DNA-päiden ligaatiota (Chatterjee et al., 2015). DNA-päiden prosessointientsyymi, joka tunnetaan myös nimellä polynukleotidikinaasi 3'-fosfaatti, on DNA-päiden prosessointientsyymi. Se voi poistaa 3'P-ryhmän DNA:sta ja fosforyloida 5'OH-ryhmän DSB-korjauksen aikana. Se sisältää myös yksijuosteisten katkeamisten (SSB) korjaamisen SSB-korjausreitin avulla (Chatterjee et al., 2015). Proteiinikinaasi DNA-PKcs on DNA:sta riippuva proteiinikinaasi, joka koostuu PIKK-kinaasien (fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasiin liittyvät kinaasit) ja ataksia telangiektasiamutatoituneiden (ATM) kinaasien perheen katalyyttisestä alayksiköstä, sekä ATM- ja Rad3-sukuisista ATR-reseptoreista, juostukatkoksista (DSB) ja yksijuostekatkoksista (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR on tarkempi ja sopivampi korjausmekanismi, koska informaatio kopioituu käyttämällä homologisen DNA-dupleksin ehjää muotoa, vaikkakin se vaatii sisarkromatidien läsnäolon. Tämä tapahtuu nisäkässolujen solusyklin S/G2-vaiheessa. HDR:ää esiintyy pääasiassa hiivaslajeissa, mutta NHEJ on kriittinen nisäkkäillä (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Täydellinen korjausmekanismi on esitetty kuvassa 1.
Koska TNBC:n aiheuttavat geneettiset ja epigeneettiset poikkeavuudet, pahanlaatuisten genomisten/epigenomisten poikkeavuuksien korjaaminen CRISPR/Cas9:llä voi olla järkevä hoitomenetelmä (Chen et al., 2019). Lisäksi jotkut soluspesifiseen transkription säätelyyn osallistuvat transkriptiotekijät voivat osoittaa syöpäsolujen ainutlaatuisia ominaisuuksia, mikä viittaa siihen, että transkription säätely voi olla erinomainen lähestymistapa syövän hoitoon (Drost et al., 2017). Näiden kasvainten molekyyliominaisuuksien, kuten geneettisten, epigeneettisten ja transkriptionaalisten vikojen, hyödyntäminen lääkekehityksessä voi parantaa kliinisiä tuloksia ja vähentää seulontakustannuksia. CRISPR on potentiaalinen geenienmuokkaustyökalu, joka ei ainoastaan ​​pysty havaitsemaan ja tunnistamaan syöpää aiheuttavia genomisia kohteita, vaan sitä voidaan myös käyttää onkogeenien muokkaamiseen, tukahduttamiseen ja epigeneettiseen modifiointiin ihmissoluissa (taulukko 1) (Ahmed et al., 2021). Useita CRISPR-seulontoja on tehty kasvainsuppressoreihin, onkogeeneihin ja lääkeresistenssiin liittyvien geenien etsimiseksi. CRISPR/Cas9:n käyttö erilaisten TNBC-onkogeenien muokkaamiseen on esitetty kuvassa 2.
Kuva 2. Erilaisten TNBC-onkogeenien geenimuokkaus CRISPR/Cas9:llä, mikä johtaa kasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden muodostumisen vähenemiseen. Näitä onkogeenejä ovat CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 ja CXCR7, Crypto1, ROR1 ja ST8SIA, jotka osallistuvat TNBC:n esiintymiseen ja etäpesäkkeiden muodostumiseen.
Syöpäsolujen migraatio, invaasio ja epiteelis-mesenkymaalinen siirtymä (EMT) liittyvät ITGA9:ään. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ITGA9 on keskeinen tekijä Notch-reitillä ja sillä on mielenkiintoinen rooli rabdomyosarkooman etäpesäkkeiden muodostumisessa (Molist et al., 2020). Lisäksi ITGA9:n havaittiin liittyvän läheisesti potilaiden ennusteeseen useissa kasvaintyypeissä, mukaan lukien rintasyöpä (Wang Z. et al., 2019). ITGA9:n bioinformatiikan analyysi osoitti, että sen ilmentyminen TNBC:ssä oli merkittävästi korkeampaa kuin muissa rintasyöpäalatyypeissä. Kohonneet ITGA9-tasot liittyvät kasvaimen etäpesäkkeisiin ja uusiutumiseen TNBC-potilailla. ITGA9:n poisto CRISPR/Cas9:llä johti syöpäkantasolujen (CSC) kaltaisiin ominaisuuksiin, kasvaimen angiogeneesiin, kasvaimen kasvuun ja etäpesäkkeiden vähenemiseen edistämällä β-kateniinin hajoamista TNBC:ssä (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 kuuluu TGF-β-perheeseen ja on kriittinen varhaiselle alkionkehitykselle, kantasolujen ylläpidolle ja syövän etäpesäkkeiden muodostumiselle (Ishii et al., 2021). Tunnetaan myös nimellä Tdgf-1, ja se on onkogeeninen GPI-ankkuroitu signalointiproteiini, joka osallistuu primitiivisen juovan, mesodermin ja endodermin muodostumisen säätelyyn sekä vasen/oikea-asymmetrian syntymiseen elinten kehityksessä alkionkehityksen aikana (Zhang et al., 2021b). Lisäksi Cripto-1:n on osoitettu osallistuvan epiteeli-mesenkymaaliseen siirtymään (EMT) kantasolumarkkerina (Zhang et al., 2021b). EMT on kriittinen paitsi useille prosesseille, kuten alkionkehitykselle, fibroosille ja haavan paranemiselle, myös syövän invaasiolle ja etäpesäkkeiden muodostumiselle. Lisäksi Cripto-1:n on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa neljän Notch-reseptorin kanssa ja edistävän niiden translaation jälkeistä kypsymistä (Brandstadter ja Maillard, 2019). Notch-signalointireitin tiedetään osallistuvan ihmisen rintasyöpäsolujen ylläpitoon. Tutkimukset ovat osoittaneet, että CRISPR/Cas9-välitteinen Crypto-1:n poisto estää syövän kasvua ja etäpesäkkeiden muodostumista. Siksi Crypto-1:stä voi tulla tärkeä terapeuttinen kohde TNBC:lle (Castro et al., 2015).
XCL12-proteiinilla ja sen kemokiinireseptorilla CXC (CXCR4 ja CXCR7) on useita rooleja syöpäsolujen lisääntymisessä, kasvussa, migraatiossa ja invaasiossa (Wu et al., 2015). Näitä kemoreseptoreita on yhdistetty TNBC:n kehitykseen useiden signalointireittien kautta sekä in vivo- että in vitro -malleissa (Wu et al., 2015). Lisäksi CXCR4:n ja CXCR7:n aktivaatio liittyy suurempaan alttiuteen metastaaseille ja huonoon ennusteeseen TNBC:ssä (Karn et al., 2022). Siksi CXCR4:n ja CXCR7:n poisto voi tulla tehokkaiksi lääkekohdegeeneiksi rintasyövän, mukaan lukien TNBC:n, hoidossa. Yang et al.:n tutkimuksessa Yang et al. (2019) käyttivät CRISPR/Cas9:ää CXCR4- ja CXCR7-geenien yhteispoistoon ja havaitsivat, että TNBC:n proliferaatio, kasvu, migraatio ja invaasio estyivät merkittävästi (Yang et al., 2019).
Rintasyöpäkudoksissa havaittiin kohonneita miR-3662:n, TNBC-onkogeenin, pitoisuuksia (Yi et al., 2022). miR-3662:n alasajon on osoitettu estävän rintasyövän kasvua ja etäpesäkkeiden muodostumista sekä in vivo että in vitro (Agarwal ja Gupta, 2021). HBP-1 on voimakas Wnt/-kateniini-signaloinnin estäjä ja todennäköisesti vastuussa miR-3662:n välittämästä TNBC-solujen kasvusta. Äskettäin Yi et al. havaitsivat, että miR-3662-HBP1-akseli säätelee Wnt/-kateniini-signalointireittiä TNBC-soluissa (Yi et al., 2022). Kasvainspesifisen ilmentymisensä vuoksi miR-3662 voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde TNBC:lle. Siten CRISPR/Cas9-välitteinen miR-3662:n alasajo voi olla erinomainen lähestymistapa uusien lääkkeiden kehittämiseen TNBC:n hoitoon.
UBR5 on 300 kDa:n nukleofosfoproteiini, joka on tunnistettu keskeiseksi kasvainten synnyn, metastaasin ja immuunivasteen säätelijäksi useissa syövissä (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5:n on raportoitu olevan erittäin voimakkaasti ilmentynyt TNBC-näytteissä ja stimuloivan ERα:n toimintaa indusoimalla proliferaatiota ubikitiiniligaasiaktiivisuutensa kautta (Bolt et al., 2015). Primaaristen TNBC-näytteiden koko eksomin sekvensointitutkimukset osoittivat myös UBR5:n ilmentymisen lisääntymistä, mikä viittaa sen rooliin TNBC:n kehityksessä. Lisäksi CRISPR/Cas9-geenin ohjaama UBR5:n deleetio osoitti merkittävää TNBC:n metastaasin ja kasvun estymistä kokeellisissa hiirimalleissa. Lisäksi UBR5:n sisällyttäminen villityypin hiirimalliin palautti sen täyden toiminnallisuuden, kun taas tätä vaikutusta ei havaittu inaktivoiduissa mutanttikannoissa (Liao et al., 2017). UBR5:n puute liittyy lisääntyneeseen apoptoosiin, nekroosiin ja kasvaimen kasvun estymiseen TNBC:ssä heikon angiogeneesin vuoksi. UBR5:n menetyksen vuoksi kasvaimen leviäminen kaukaisiin elimiin vähenee, ja UBR5 indusoi epänormaalia epiteelis-mesenkymppisyövää (EMT) pääasiassa vähentämällä E-kadheriinin ilmentymistä (Zhang ja Weinberg, 2018). Äskettäin UBR5:n osoitettiin olevan erittäin tärkeä tekijä IFN-γ:n indusoimassa PDL1-transkriptiossa TNBC:ssä johtuen sen E3-ubikitinaatioaktiivisuuden puutteesta. RNA-transkriptomianalyysi paljasti, että UBR5:llä voi olla systeemisiä vaikutuksia IFN-γ-reittiin liittyviin geeneihin ja se voi edistää PDL1-transaktivaatiota lisäämällä proteiinikinaasi-RNA:n (PKR) ja sen signaalitransduktorien ja aktivaattoreiden aktivaatiotasoja. Transkriptio 1:n (STAT1) ja interferonisäätelytekijä 1:n (IRF1) aktivaatiotasoja. CRISPR/Cas9-välitteisellä yhdistetyllä UBR5:n ja PD-L1:n ilmentymisen ablaatiolla on kuitenkin synergistinen terapeuttinen vaikutus kuin kummallakaan yksinään tapahtuvalla estomenetelmällä, ja sillä on merkittäviä vaikutuksia kasvaimen mikroympäristöön (Wu et al., 2022). Siten CRISPR/Cas9 voi olla tärkeä työkalu UBR5:n toiminnan estämiseksi, mikä tukahduttaa TNBC:n metastaaseja ja kasvaimen kasvua.
ROR1 on tyypin I transmembraaniproteiini, jota ilmentyy syövän ja alkionkehityksen aikana, ja se on tunnistettu onkofetaaliseksi proteiiniksi (Nicholas Borcherding, 2014). Useiden ihmisen syöpien invasiivinen käyttäytyminen liittyy ROR1:n lisääntyneeseen ilmentymiseen. Lupaavia tuloksia on saatu in vivo- ja in vitro -tutkimuksista, joissa on käytetty ROR1:een kohdistuvia terapeuttisia yhdisteitä (Chien et al., 2016). Kohonneita ROR1-mRNA-tasoja rintakudosbiopsioissa on myös yhdistetty aggressiivisiin basaalimaisiin rintakasvaimiin (BL) ja niiden kulkeutumiseen muihin kehon osiin. Lisäksi ROR1:n liikailmentyminen on tunnistettu ennustetekijäksi TNBC:n kehittymiselle (Chien et al., 2016). ROR1:n hiljentäminen CRISPR/Cas9:llä TNBC:n kasvun ja metastaasin estämiseksi olisi kuitenkin tehokas strategia.
Sialylaatioprosessiin kuuluu siaalihapon liittyminen glykokonjugaatteihin, mitä sialyylitransferaasit (ST) katalysoivat. ST8SIA1 kuuluu ST-perheeseen ja sillä on tärkeä rooli useiden sairauksien, kuten lymfosyyttisen leukemian ja kolorektaalisyövän, patogeneesissä (Chang et al., 2018). RNA-sekvenssianalyysi osoittaa, että ST8SIA1:tä ilmentyy runsaasti TNBC-potilaiden rintakudoksessa ja se korreloi positiivisesti kasvainsuppressorigeenin p53 mutaatioiden kanssa, mikä voi vaikuttaa TNBC:n patogeneesiin (Battula et al., 2017). Lisäksi ST8SIA1 osallistuu TNBC:n metastaasiin ja uusiutumiseen, mikä viittaa siihen, että sillä on tärkeä rooli TNBC:n esiintymisessä ja kehittymisessä. TNBC:n in vitro -mallissa osoitettiin, että ST8SIA1:n alasajo CRIPSR/Cas9:llä estää kasvua ja metastaaseja (Battula et al., 2017). Tämä viittaa siihen, että CRISPR/Cas9 voi olla tärkeä työkalu ST8SIA1-onkogeenin toiminnan estämiseksi TNBC:n hoidossa.
NAT1 on metabolinen entsyymi, joka katalysoi faasi II:n vierasaineiden muodostumista ja jota ilmentyy lähes kaikissa ihmiskudoksissa. NAT1 voi käyttää kofaktori folaattia asetyyli-CoA:n (asetyyli-CoA) kohdistamiseen jopa ilman aromaattista amiinisubstraattia (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Tutkimukset ovat osoittaneet, että NAT1 säätelee matriksin metalloproteinaasi 9:n (MMP9) toimintaa rintasyöpäsolumalleissa ja suojaa reaktiivisilta happilajeilta (ROS) glukoosipuutoksen aikana (Wang et al., 2018). NAT1:n deleetion on osoitettu estävän pyruvaattidehydrogenaasikompleksia, mikä johtaa mitokondrioiden toimintahäiriöön (Wang L. et al., 2019). Lisäksi useat muut raportit ovat osoittaneet, että NAT1:n esto pienillä molekyyleillä ja siRNA-vaimentamisella voi vähentää rintasyöpäsolujen invasiivisuutta ja lisääntymistä (Stepp et al., 2018). Äskettäin CRISPR/Cas9:ää käytettiin NAT1:n suppressioon rintasyöpäsolulinjassa MDA-MB-231, mikä vaikutti solujen aineenvaihduntaan sen ilmentymistasosta riippuen. Tämä tutkimus osoitti myös, että NAT-1 on kriittinen TNBC:n etenemiselle ja metastaasille (Carlisle et al., 2020).
Onkogeenien koordinoitua transkriptiota säätelevät supertehostajat, transkriptiotekijät ja kofaktorit (Hnisz et al., 2015). Lisäksi transkription säätelyyn tarvitaan ryhmä sykliiniriippuvaisia ​​kinaaseja (CDK), kuten CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 ja CDK13. Näistä CDK7 osallistuu RNA-polymeraasi II:n fosforylaatioon, mikä on erittäin tärkeää onkogeenitranskription alkamiselle ja laajentumiselle TNBC:n patogeneesissä. Eräässä uraauurtavassa tutkimuksessa CRISPR/Cas9:n aiheuttama CDK7:n deleetio esti TNBC:tä, mikä osoittaa, että TNBC:n patogeneesi on CDK7-riippuvainen (Wang Y. et al., 2015).
Tutkimukset ovat osoittaneet, että MYC- ja RBP-geenien (RNA:ta sitova proteiini) mutaatiot voivat johtaa apoptoosiin, kun taas yksittäisten geenien mutaatiot MYC- tai RBP-geeneissä eivät vaikuta syöpäsolujen kasvuun (Einstein et al., 2021). Yli 1000 RBP:tä ihmisen genomissa on seulottu CRISPR/Cas9-pohjaisen kirjaston avulla. Niistä 57 RBP:n havaittiin olevan kriittisiä syöpäsolujen kasvulle, joilla on erittäin kohonneet MYC-tasot (Wheeler et al., 2020). Lisäksi YTHDF2 on tärkeä TNBC-solujen kasvun ylläpitämiselle ja vähentää metyloituneiden transkriptien määrää korkean transkriptiotason ja translaation aikana syöpäsoluissa, joissa on korkea MYC-ilmentymä. Lisäksi YTHDF2 ei ole välttämätön syöpäsoluille, jotka ovat vähemmän riippuvaisia ​​kohonneista MYC-tasoista pidentääkseen TNBC-potilaiden eloonjäämistä (Einstein et al., 2021), mikä viittaa siihen, että se voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde lääkkeille, jotka voivat voittaa TNBC:n.
Sinkkisormiproteiinit (ZNF) muodostavat noin 1 % ihmisen koko genomista. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ZNF voi säädellä solujen lisääntymistä useissa syövissä, kuten maksasyövässä, rintasyövässä ja paksusuolen syövässä (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR-poistogeenin avulla tuotettuja kirjastoja on käytetty erilaisten kasvainsuppressorigeenien (TSG) seulontaan rintasyöpäsoluissa (Shalem et al., 2014). Sittemmin CRISPR/Cas9 ZNF319-deletoitujen rintasyöpäsolujen transkriptoominen tutkimus on osoittanut, että ZNF319 on kasvainsuppressorigeeni, joka vähentää rintasyövän lisääntymistä ja on siksi mukana useissa mahdollisissa signalointimekanismeissa ja muissa biologisissa toiminnoissa (Wang L. et al., 2022).
Ferroptoosi on ohjelmoidun solukuoleman tyyppi, joka on riippuvainen raudan läsnäolosta. Tiedetään, että lipidiperoksidien läsnäolo vaikuttaa ferroptoosin kehittymiseen. Lisäksi PKCβII:n on raportoitu osoittavan varhaista lipidiperoksidaatiota, ja lisääntynyt lipidiperoksidaatio liittyy ferroptoosiin. CRISPR/Cas9-välitteisten kinaasi-inhibiittorien kirjaston seulonta paljasti, että PKCβII osallistuu lipidiperoksidaatioprosessiin, joka on kriittinen ferroptoosille MDA-MB-231-soluissa (Zhang et al., 2022). Tämä viittaa siihen, että PKCβII:n poisto CRISPR/Cas9:llä voi olla potentiaalinen kasvainsuppressorigeenikohde ferroptoosiin liittyvien sairauksien hoidossa (Zhang et al., 2022).
Lääkeresistenssin uskotaan olevan vastuussa noin 90 prosentista syöpäpotilaiden kuolemista, ja se on yksi suurimmista haasteista syövän hoidossa (Bukowski et al., 2020). Tulokset osoittavat, että riittävä määrä lääkeaineiden ulosvirtaukseen, DNA:n korjaukseen, apoptoosiin ja erilaisiin solusignalointireitteihin liittyviä geenejä liittyy lääkeresistenssiin (Haider et al., 2020). Näistä useisiin geeneihin on kohdistettu CRISPR/Cas9-työkaluja, ja ne ovat osoittaneet lupaavia tuloksia lääkeresistenssin vähentämisessä ja syöpähoitojen tehokkuuden lisäämisessä (Vaghari-Tabari et al., 2022). Lisäksi suuren läpimenon CRISPR/Cas9-geenin poistoseulontakirjastojen on osoitettu vaikuttavan potentiaalisten lääkeresistenssigeenikohteiden toimintaan (Shalem et al., 2015). Paklitakseliresistenssigeenien tunnistamiseksi käytettiin RNA-sekvensointia yhdistettynä koko genomin kattavaan sgRNA-kirjaston seulontaan kahdeksan ehdokasgeenin tunnistamiseksi, mukaan lukien histonideasetylaasi 9 (HDAC9), jotka liittyvät lääkeresistenssiin potilailla, joilla on uusiutuva tripla-syöpä (B et al., 2020). Toisessa tutkimuksessa havaittiin diseriini/treoniinin ja tyrosiiniproteiinikinaasin (DSTYK) lisääntynyttä ilmentymistä syöpälääkkeillä hoidettujen TNBC-potilaiden eloonjäämisen aikana. Lisäksi CRISPR/Cas9-välitteinen DSTYK:n alasajo edisti merkittävästi lääkeresistenttien syöpäsolujen apoptoosia in vitro (SUM102PT-solut ja MDA-MB-468-solut) ja in vivo TNBC-mallissa (Ogbu et al., 2021).
Vaikka TNBC-soluissa on poikkeava MAPK-reitin aktivaatio, MEK-kohdennettujen hoitojen kliininen teho on heikko. CRISPR/Cas9-genomikirjaston seulonta paljasti, että PSMG2:n (proteomikokoonpanon kaperoni 2) esto herkistää TNBC-BT549- ja MB468-solut MEK-inhibiittorille AZD6244. CRISPR/Cas9:n aiheuttama PSMG2:n alasajo muutti normaalia proteasomin toimintaa, mikä johti autofagiavälitteiseen PDPK1:n purkautumiseen ja siten paransi entisestään kasvainsoluja TNBC-hiirimalleissa, joita indusoivat AZD6244 (MEK-inhibiittori) ja MG132 (proteasomin inhibiittori). Siten proteasomin ja MAP-kinaasin (MEK) estäjiä voidaan antaa synergistisesti kasvainsolujen lisääntymisen vähentämiseksi (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9-geeniä on käytetty myös seulomaan geenitoiminnan menetystä, joka johtaa TNBC-syövän resistenssiin (Shu et al., 2020). Ge et al. selittivät JQ1:llä, BET-bromodomeeni-inhibiittorilla (BBDI), käsiteltyjen syöpäsolujen lääkeresistenssin mekanismia TNBC:ssä. CRISPR/Cas9-geenin avulla he havaitsivat, että rb1-geenin poistaminen aiheutti TNBC:stä resistenssin syöpälääke JQ1:lle. Siksi rb1:n toiminta on tärkeää vasteessa JQ1-lääkkeille TNBC:ssä. He raportoivat myös, että paklitakseli on CDK4/6-kinaasi-/mikrotubulus-estäjä, ja sen yhdistelmä BBDI:iden, kuten JQ1:n, kanssa voi tarjota lupaavia terapeuttisia vasteita lääkeresistentteihin TNBC-syöpiin (Ge et al., 2020).
Pitkän ei-koodaavan RNA:n (lncRNA) transkriptionaalisen maiseman on raportoitu olevan vastuussa neoadjuvanttihoidon resistenssistä TNBC:ssä. Tämä tutkimus osoittaa, että viittä eri MALAT1:n lncRNA-transkriptiä ilmentyy voimakkaasti TNBC:ssä. Lisäksi CRISPR/Cas9-välitteinen MALAT1:n deleetio lisäsi TNBC:n BT-549-solujen herkkyyttä paklitakselille ja doksorubisiinille, mikä viittaa MALAT1-resistenssin mahdolliseen rooliin TNBC:ssä (Shaath et al., 2021).
BRCA1-geenin (BRCA1m) mutaatiot ovat heterogeenisiä ja siksi vaikeasti havaittavia. PARP1:n (poly(ADP-riboosi) polymeraasi), BRCA1:n synteettisen letaalikumppanin, kohdentaminen voi lisätä TNBC-solujen lääkekemoherkkyyttä. CRISPR/Cas9-geenin avulla PARP1:n deleetio lisäsi syöpälääkkeiden, kuten doksorubisiinin, gemsitabiinin ja dosetakselin, herkkyyttä mBRCA1-mutanttisille TNBC-soluille, mikä viittaa siihen, että PARP1 on myös osallisena lääkeresistenssissä TNBC:ssä (Vaghari-Tabari ym., 2022). . Kasvainsuppressorigeenien BRCA1 tai BRCA2 mutaatioiden tiedetään lisäävän rintasyövän kehittymisen todennäköisyyttä ihmisillä. Näiden potilaiden hoito edellyttää PARP-estäjien käyttöä. Lisäksi on osoitettu, että nukleotidipelastustekijän DNPH1 poisto CRISPR/Cas9:llä voi poistaa myrkyllisen nukleotidi 5-hydroksimetyylideoksiuridiini (hmdU) monofosfaatin, mikä parantaa BRCA-puutteellisten solujen vastetta PARP-estäjien herkkyyteen (Fugger ym., 2021). Siten CRISPR/Cas9- ja PARP1-estäjistä voi tulla tärkeä hoitostrategia TNBC:lle.
Penetrantti glykoproteiini (P-gp) on monilääkeresistenssigeeni, jonka ilmentyminen on yleisesti ottaen lisääntynyt noin 41 %:ssa kaikista TNBC-syövistä (Sun et al., 2020). P-gp:n indusoiman lääkeaineen ulosvirtauksen on tunnistettu olevan keskeinen lääkeresistenssin säätelijä rintasyövässä. P-gp:n estäjien on osoitettu lisääntyneen herkkyyden syöpälääkkeille rintasyövässä (Famta et al., 2021). Siten CRISPR/Cas9-välitteinen P-gp:n ja P-gp:n estäjien ablaatio tai suppressio voi olla erittäin tärkeä menetelmä lääkeresistenssin voittamiseksi TNBC:ssä.
ATP:tä sitovan kasettikuljettajaproteiinin G2:n (ABCG2) tiedetään aiheuttavan lääkeresistenssiä TNBC:ssä (Palasuberniam et al., 2015), vaikka tällä hetkellä ei ole raportteja CRISPR/Cas9:n ja ABCG2:n vaimentamisen sekä kasvainsuppressorigeenien inaktivoinnin välisestä yhteydestä. PTEN saattaa tehostaa ABCG2:n aktivaatiota (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Siksi CRISP/Ca9:n käyttö ABCG2:n poistamiseksi ja sen yhdistäminen ABCG2-estäjään voi olla sopiva hoito lääkeresistenssin voittamiseksi TNBC:ssä. Taulukossa 2 mainitaan CRISPR/Cas9, joka kohdistuu kaikkiin resistenssigeeneihin.
Taulukko 2. CRISPR/Cas9 kohdistuu erilaisiin TNBC-resistenssigeeneihin herkistääkseen soluja syöpälääkkeille.
CRISPR/Cas9-kirjastot ovat potentiaalisia työkaluja syövän patogeneesiin liittyvien geenimutaatioiden seulontaan (Chan et al., 2022). Tämä seulontamenetelmä käsittää neljä vaihetta: (a) kirjaston rakentamisen, (b) lentiviraalisen transduktion, (c) fenotyyppisen seulonnan ja (d) kohdegeenianalyysin. Vaikka TNBC:ssä on MAPK-reitin epänormaali aktivaatio, MEK-kohdennetun hoidon kliininen ennuste TNBC-potilailla, joilla on mutaatioita kasvainsuppressorigeeneissä, kuten PTEN, RB1 ja TP53.
Lisäksi CRISPR/Cas9-geenien poistoseulonnassa testattiin tehokkainta ja selektiivisintä molekyyliä, dehydrocatrolia, jota esiintyy runsaasti Guatemalan kukka- ja lehtiuutteissa, jotta ymmärrettäisiin dehydrocatrolin vaikutusta MDA-MB-231:een. Selektiivisen solusytotoksisuuden mekanismit. TNBC-alatyyppien mesenkymaaliset varsirakenteen ominaisuudet. Tämä CRISPR/Cas9-pohjainen seulonta paljasti myös, että HSD17B11, 17β-hydroksisteroididehydrogenaasi tyyppiä 11 koodaava geeni, ilmentyy voimakkaasti MDA-MB-231-soluissa ja johtaa MDA-MB-231-soluille spesifiseen dehydrofalkarinoliin (Grant et. al., 2020). Tämä viittaa siis siihen, että CRISPR/Cas9-genomiseulonnalla on suuri potentiaali mahdollisten luonnollisten yhdisteiden syöpää estävien ominaisuuksien taustalla olevien mekanismien tunnistamisessa.
Lisäksi TNBC:n alttiutta syöpään tutkittiin käyttämällä puolueetonta, koko genomin kattavaa in vivo CRISPR/Cas9-seulontaa, joka osoitti yhteyden onkogeenisten ja kasvaimia suppressoivien reittien välillä. mTOR- ja Hippo-reittien keskeisten komponenttien on raportoitu olevan tärkeässä roolissa kasvaimen säätelyssä TNBC:ssä. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että mTORC1/2:n ja YAP-onkoproteiinin farmakologinen esto estää tehokkaasti TNBC:n patogeenisuutta käyttämällä in vitro -lääkematriisi-synergiamallia ja potilaasta peräisin olevia in vivo -ksenografteja. Lisäksi Torin-1:n välittämä mTORC1/2:n esto lisää makropinosytoosia, kun taas verteporfiinin indusoima YAP:n esto johtaa TNBC-solukuolemaan. Yhdessä nämä tulokset korostavat koko genomin kattavan in vivo CRISPR-seulonnan tehoa ja luotettavuutta uusien ja tehokkaiden TNBC-hoitojen tunnistamisessa (Dai et al., 2021).
Immuunijärjestelmän säätelyhäiriöt ovat tärkeä tekijä kasvainten synnyssä. Syöpäsolut välttävät immuunijärjestelmän poiston ohittamalla puolustusmekanismeja, mukaan lukien häiritsemällä immuunisolujen toimintaa kasvaimen mikroympäristössä ja heikentämällä immuunijärjestelmää. Siksi paremman immuunijärjestelmän kehittäminen voi olla keskeinen lähestymistapa kasvainten torjunnassa. CRISPR/Cas9-pohjaisen geenimuokkauksen käyttö ratkaisee useita immuunijärjestelmän toimintahäiriöihin liittyviä ongelmia eri näkökulmista. CRISPR/Cas9:ää on käytetty parantamaan kasvainten vastaista immuniteettia rintasyöpää vastaan ​​seuraavien reittien kautta (kuva 3).
Kuva 3. CRISPR/Cas9-immunoterapia kohdistuu TNBC-soluihin. CDK5:n menetys sekä PDL1:n ja CD155:n alasajo tehostavat immuunijärjestelmää. Samoin A2AR:n menetys ja TAA:iden, kuten HER2:n, musiini 1:n ja TEM8:n, alasajo lisäsivät CAR-T-solujen tehokkuutta syöpäsolujen tappamisessa. CRISPR/Cas9-pohjainen T-soluseulonta on osoittanut, että p38-kinaasin häiriintyminen tehostaa T-solujen kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta. CRISPR/Cas9:n muokkaamat T-solut lisäävät TCR:n (T-solureseptorin) ilmentymistä, mikä johtaa T-soluihin, joilla on kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta.
Immunoterapian tavoitteena on stimuloida immuunijärjestelmää hyökkäämään syöpäsoluja vastaan. Immuunitarkastuspisteproteiinien yliekspressio yleensä estää autoimmuunireaktioita, mutta se voi auttaa syöpiä välttämään niitä (Topalian et al., 2015). Nämä proteiinit estävät immuunireaktioita sitoutumalla immuunisolujen pinnalla oleviin reseptoreihin. Useat tarkastuspisteproteiinit (kuten CD155 ja PD-L1) kohdistuvat immuunisolujen PD-1-reseptoriin ja niitä ilmentyy rintasyövässä, erityisesti TNBC:ssä (Li Y.-C. et al., 2020). PD-L1:n tai sen reseptorin alasajo CRISPR/Cas9:llä voi stimuloida immuunijärjestelmää hyökkäämään TNBC-kasvaimia vastaan ​​(Yahata et al., 2019). Lisäksi PD-L1:n ilmentymisen vähentämisen CRISPR/Cas9-välitteisen CDK5:n deleetion kautta on osoitettu estävän kasvainten kasvua in vitro ja in vivo (Deng et al., 2020). Kasvun estyminen rintasyövän in vitro- ja in vivo -malleissa viittaa siihen, että shRNA:n välittämällä CD155:n vähenemisellä voi olla terapeuttinen vaikutus rintasyöpään (Gao et al., 2018).
CAR-T-solut ilmentävät kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) tunnistavia CAR-reseptoreita ja voivat käyttää tarkistuspisteproteiinien alasajoa aktiivisuutensa tehostamiseksi (Li C. et al., 2020). CAR-T-soluhoidolle on useita potentiaalisia kohteita rintasyövässä, mukaan lukien useat TAA-solut, kuten HER2, musiini 1 ja TEM8 (Bajgain et al., 2018). On näyttöä siitä, että mesoteliiniin (yli-ilmentyvät TNBC BT-459 -soluissa) kohdistuvat CAR-T-solut ovat tehokkaampia syöpää vastaan, kun PD-1 poistetaan käytöstä CRISPR/Cas9:llä (Hu et al., 2019). T-solujen eristäminen potilaista ja niiden muokkaaminen ex vivo on kuitenkin työvoimavaltainen ja aikaa vievä prosessi. Vaikka universaalit T-solut voivat vähentää eristämisvaatimuksia, ihmisen leukosyytti-antigeenin (HLA) luokan I ja T-solureseptorin (TCR) ilmentävät luovuttaja-T-solut tulisi poistaa käänteishyljintäpoikkeavuuksien estämiseksi (Ren et al., 2017a). CRISPR/Cas9:n avulla HDR voi samanaikaisesti eliminoida TCR:n ja HLA:n ja poistaa CAR:ia koodaavan geenin. Tutkimukset ovat osoittaneet, että CRISPR/Cas9:ää voidaan käyttää anti-CD19-CAR-reseptorien viemiseen TCR-lokukseen, jolloin CAR-reseptorit tuotetaan tehokkaasti ilman T-solujen hävittämistä (Dimitri et al., 2022). Multipleksitekniikoita on kehitetty allogeenisten CAR-T-solujen tuottamiseksi eliminoimalla samanaikaisesti TCR:ää, beeta-2-mikroglobuliinia (B2M), HLA-I-alayksikköä ja muita proteiineja, kuten PD-1:tä ja CTLA-4:ää, joilla voi olla paremmat syöpää estävät ominaisuudet TNBC:tä vastaan ​​(Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
CRISPR/Cas9:n käyttö voisi parantaa CAR-T-solujen tehokkuutta. Adenosiinin tiedetään omaavan immunosuppressiivisia ominaisuuksia ja se voi vähentää syöpää estävää immuniteettia estämällä T-solujen toimintaa ja aktivoimalla adenosiini A2A-reseptoreita (A2AR) (Vigano et al., 2019). A2AR:n hiljentäminen CRISPR/Cas9:llä paransi merkittävästi CAR-T-solujen tehokkuutta in vivo (Giuffrida et al., 2021). T-solujen tiedetään osoittavan erilaisia ​​fenotyyppisiä ominaisuuksia, kuten solujen laajenemista, erilaistumista, oksidatiivista stressiä ja genomista stressiä. CRISPR/Cas9-pohjainen T-solujen seulonta paljasti 25 eri T-solureseptorikinaasin häiriintymisen. Näistä p38-kinaasin deleetion on osoitettu lisäävän T-solujen kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta, mikä osoittaa, että p38-kinaasi on CAR-T-solujen säätelyn keskeinen säätelijä (Gurusamy et al., 2020).
T-soluja voidaan geneettisesti muokata CRISPR/Cas9:n avulla voimakkaasti ilmentyvien T-solujen (TCR) tuottamiseksi. Geneettisesti muunneltujen T-solujen siirtäminen potilaille on osoittanut voimakkaampaa syöpää estävää aktiivisuutta kuin endogeenisten T-solujen. Siksi endogeeniset T-solut voivat kilpailla geneettisesti muunneltujen T-solujen kanssa potilailla, mikä voi vaikuttaa syövän immunoterapian potentiaaliin. Tämän ongelman ratkaisemiseksi CRISPR/Cas9:n käyttö endogeenisen TCR-β:n poistamiseen vastaanottajasoluista ja sen jälkeen TCR-β T-solujen siirtäminen syöpäpotilaille voi osoittaa parempia syöpää estäviä immuunivasteita ilman endogeenisen TCR:n seksuaalista kilpailua (Fan et al. 2018). Siten, lukuun ottamatta CRISPR-modifioituja T-soluja, TCR:t ovat tuhat kertaa herkempiä kasvainantigeeneille kuin normaalit TCR-transdusoidut T-solut. Lisäksi useissa leukemioissa γδ ​​TCR+ CRISPR:n tuottamat muuttuneet T-solut ilmentävät enemmän CD4+- ja CD8+-T-soluja kuin tavanomainen TCR-siirto (Legut et al., 2018). Siten CRISPR/Cas9:n tuottamat modifioidut T-solut voivat olla tehokas immunoterapiamenetelmä TNBC:n voittamiseksi.
Integriinit ovat soluadheesiomolekyylejä, joita esiintyy solujen transmembraaneissa ja jotka edistävät solujen sitoutumista solunulkoiseen matriisiin (ECM) (Hamidi ja Ivaska, 2018). Integriinien säätelyn häiriöt liittyvät syövän kehittymiseen ja migraatioon muuttamalla solunulkoista matriisia, mikä johtaa syöpäsolujen selviytymiseen verenkierrossa (Hamidi ja Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-välitteinen integriinien alasajo hidastaa kasvaimen etenemistä, metastaaseja ja kolonisaatiota TNBC:ssä. Integriini α5:n (ITGA5) alasajon on raportoitu vähentävän solujen migraatiota ja etenemistä muissa syövissä, kuten keuhkosyövässä (Ju et al., 2017), mikä viittaa siihen, että integriini α5 voi myös olla keskeinen tekijä TNBC:n patogeneesissä.
Perinteisillä alkion kantasolumenetelmillä (ES) poistettujen hiirten tuottaminen on työvoimavaltainen, aikaa vievä ja tehoton prosessi. ES-solujen kohdentaminen homologisen rekombinaation avulla, kimeeristen hiirten jalostus ja niiden risteyttäminen heterotsygoottisten hiirten kanssa homotsygoottisten jälkeläisten tuottamiseksi vie kuukausia ja vuosia. Useiden geneettisten mutaatioiden omaavien hiirten luominen vaatii monimutkaista risteytymistä. Kuitenkin monia ongelmia on ilmennyt käytettäessä hiiriä, jotka on luotu poistamalla ES-soluja CRISPR/Cas9-tekniikalla tai mikroinjektoimalla CRISPR/Cas9-komponentteja yksisoluisiin hedelmöitettyihin munasoluihin. Esimerkiksi muutosten tekeminen tapahtuu usein kaksialleelisissa lokuksissa, eikä se ole geenispesifistä. Äskettäin raportoitiin, että CRISPR/Cas9-teknologiaa käyttävät ES-solut voivat samanaikaisesti lisätä kaksialleelisia mutaatioita jopa viiteen geeniin (Nishizono et al., 2021). Tätä tarkoitusta varten Cas9-mRNA:ta ja viisi geenispesifistä gRNA:ta transfektoitiin samanaikaisesti ES-soluihin. Tämä korostaa tämän menetelmän lupaavuutta ja tehokkuutta, vaikka nämä mutaatiot ovat saattaneet siirtyä eteenpäin, kun perustajalinjoja jalostettiin viisinkertaisten poistettujen hiirten tuottamiseksi. Tutkimuksessa raportoidaan myös yllättävä löydös: ES-soluja ei enää tarvita geneettisesti muunneltujen hiirten luomiseen. Sen sijaan tiettyjen geenituotteiden poistamiseksi Cas9-mRNA:ta ja -gRNA:ta injektoitiin yksisoluvaiheen alkioihin. Tuloksena on luotu knockout-perustajalinjoja, joita voidaan teoriassa käyttää geenien deleetion seurausten tutkimiseen hiirillä (Qin et al., 2016). CRISPR/Cas9 mahdollistaa siis transgeenisten hiirten luomisen TNBC:n hoitamiseksi halvemmalla kuin perinteinen geenitekniikka. CRISPR/Cas-järjestelmää käyttämällä on kehitetty uusi knockout-hiirimalli, joka voi onnistuneesti tehdä pistemutaatioita yhteen tai useampaan TNBC:n endogeeniseen geeniin. Tämän konseptin perusteella TNBC:n eläinmalleja voidaan kehittää myös käyttämällä CRISPR/Cas9-välitteistä BRCA1:n ja p53:n deleetiota, mikä johtaa HR-korjauksen menetykseen, genomin epävakauteen ja mutanttifenotyyppeihin (Annunziato et al., 2020).
Tällä hetkellä TNBC:n diagnosoinnissa käytetään erilaisia ​​menetelmiä, kuten mammografiaa, magneettikuvausta (MRI) ja ultraääntä. Näillä menetelmillä on kuitenkin joitakin rajoituksia. Mammografiaa käytetään paikallisen rintakudoksen diagnosointiin pikemminkin kuin etäpesäkkeiden, joissa syöpäsolut ovat siirtyneet muihin elimiin. Ultraäänitutkimus ei ole luotettava menetelmä TNBC:n diagnosointiin (Chen ja Lee-Felker, 2023). Magneettikuvauksella on suurempi herkkyys kuin ultraäänellä ja mammografialla, mutta sen diagnostinen tarkkuus on rajallinen (Sha ja Chen, 2022). Kudosbiopsia on invasiivinen tapa tunnistaa syöpäsoluja. Joissakin tapauksissa biopsia voi kuitenkin jäädä huomaamatta syöpäkudosta, jos neula harhautuu pois kiinnostuksen kohteena olevasta alueesta. Lisäksi se on erittäin kallista ja voi olla potilaalle traumaattinen. TNBC on heterogeeninen syöpätyyppi, joten biopsia ei välttämättä anna riittävästi tietoa syövän tyypistä. Siksi tarvitaan kiireellisesti uusi diagnostisesti luotettava menetelmä TNBC:n havaitsemiseksi. CRISPR/Cas9 voi toimia erittäin herkkänä ja minimaalisesti invasiivisena vaihtoehtona rintasyövän diagnosoinnissa. Tätä varten CRISPR/Cas9-pohjaisia ​​strategioita voidaan käyttää parantamaan PCR-menetelmiä TNBC:n diagnostiikassa. Ensin CRISPR-järjestelmän Cas9- ja cpf1-proteiineja käytetään epäspesifisen DNA:n poistamiseen, ja sitten nämä kaksi proteiinia (Cas9 ja cpf1) voivat tunnistaa PAM-sekvenssin ennen sitoutumista kohde-DNA:han (Deepak Singh et al., 2021). Siten PCR voi tunnistaa syövän kehittymiseen liittyviä mutaatioita. Useissa tutkimuksissa on käytetty tätä CRISPR-pohjaista strategiaa erilaisten mutaatioiden havaitsemiseksi eri syövissä (Safari et al., 2019). Siten CRISPR-pohjaiset PCR-menetelmät voivat vähentää TNBC-diagnostiikan riippuvuutta invasiivisista menetelmistä, kuten biopsiaan perustuvasta immunohistokemiasta.
Myös TNBC:ssä on osoitettu genotyyppisiä muutoksia hormonireseptorien säätelyssä (Chen ja Russo, 2009). CRISPR/Cas9-pohjaiset PCR-strategiat, joissa käytetään mikrosiruja hoitopistediagnostiikkaan, voivat tehokkaasti seurata näitä mutaatioita (Hajian et al., 2019). Se voisi myös tarjota terveydenhuollon ammattilaisille relevanttia tietoa tietyistä TNBC-potilaiden mutaatioista, mikä voisi auttaa parantamaan heidän hoitoprosessiaan. Tällä yhdistetyllä tekniikalla on kuitenkin rajoituksensa. Siksi tarvitaan laajoja tutkimusponnisteluja, ennen kuin tätä CRISPR/Cas-PCR-menetelmää voidaan käyttää terveydenhuollossa TNBC:n diagnosointiin (Yang et al., 2019).