Tietokonetomografialla (CT) tunnistettujen keuhkojen kyhmyjen erotusdiagnoosi on edelleen haaste kliinisessä käytännössä.Tässä luonnehdimme 480 seeruminäytteen globaalia metabolomia, mukaan lukien terveet kontrollit, hyvänlaatuiset keuhkojen kyhmyt ja I vaiheen keuhkojen adenokarsinooma.Adenokarsinoomilla on ainutlaatuiset metaboliset profiilit, kun taas hyvänlaatuisilla kyhmyillä ja terveillä yksilöillä on suuri samankaltaisuus metabolomissa profiileissa.Löytöryhmässä (n = 306) tunnistettiin 27 metaboliitin sarja erottamaan hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset kyhmyt.Erottelevan mallin AUC sisäisen validoinnin (n = 104) ja ulkoisen validoinnin (n = 111) ryhmissä oli 0,915 ja 0,945.Reittianalyysi paljasti lisääntyneet glykolyyttiset metaboliitit, jotka liittyvät tryptofaanin vähentymiseen keuhkojen adenokarsinooman seerumissa verrattuna hyvänlaatuisiin kyhmyihin ja terveisiin kontrolleihin, ja ehdotti, että tryptofaanin sisäänotto edistää glykolyysiä keuhkosyöpäsoluissa.Tutkimuksemme korostaa seerumin metaboliittien biomarkkerien arvoa arvioitaessa TT:llä havaittujen keuhkojen kyhmyjen riskiä.
Varhainen diagnoosi on ratkaisevan tärkeää syöpäpotilaiden eloonjäämisasteen parantamiseksi.Yhdysvaltain kansallisen keuhkosyövän seulontatutkimuksen (NLST) ja eurooppalaisen NELSON-tutkimuksen tulokset ovat osoittaneet, että seulonta pieniannoksisella tietokonetomografialla (LDCT) voi merkittävästi vähentää keuhkosyöpäkuolleisuutta korkean riskin ryhmissä1,2,3.Sen jälkeen, kun LDCT:tä on käytetty laajalti keuhkosyövän seulonnassa, oireettomien keuhkokyhmyjen sattumanvaraisten röntgenlöydösten ilmaantuvuus on jatkanut kasvuaan 4 .Keuhkokyhmyt määritellään halkaisijaltaan enintään 3 cm:n polttopisteinä 5 .Meillä on vaikeuksia arvioida pahanlaatuisuuden todennäköisyyttä ja käsitellä LDCT:ssä sattumanvaraisesti havaittuja suuria keuhkokyhmyjä.TT:n rajoitukset voivat johtaa toistuviin seurantatutkimuksiin ja vääriin positiivisiin tuloksiin, mikä johtaa tarpeettomiin toimenpiteisiin ja ylihoitoon6.Siksi on kehitettävä luotettavia ja hyödyllisiä biomarkkereita keuhkosyövän tunnistamiseksi oikein varhaisessa vaiheessa ja useimpien hyvänlaatuisten kyhmyjen erottamiseksi alkuvaiheessa 7 .
Veren (seerumi, plasma, perifeerisen veren mononukleaarisolut) kattava molekyylianalyysi, mukaan lukien genomiikka, proteomiikka tai DNA-metylaatio8,9,10, on johtanut kasvavaan kiinnostukseen keuhkosyövän diagnostisten biomarkkerien löytämiseen.Samaan aikaan metabolomiikan lähestymistavat mittaavat solun lopputuotteita, joihin vaikuttavat endogeeniset ja eksogeeniset vaikutukset, ja siksi niitä käytetään ennustamaan sairauden alkamista ja lopputulosta.Nestekromatografia-tandemmassaspektrometria (LC-MS) on laajalti käytetty menetelmä metabolomiikkatutkimuksiin sen korkean herkkyyden ja suuren dynaamisen alueen ansiosta, joka voi kattaa metaboliitteja, joilla on erilaisia fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia11,12,13.Vaikka plasman/seerumin globaalia metabolomista analyysiä on käytetty tunnistamaan keuhkosyövän diagnoosiin 14, 15, 16, 17 ja hoidon tehokkuuteen liittyviä biomarkkereita18, seerumin metaboliittien luokittelijat hyvänlaatuisten ja pahanlaatuisten keuhkojen kyhmyjen erottamiseksi toisistaan on vielä paljon tutkimatta.- massiivinen tutkimus.
Adenokarsinooma ja okasolusyöpä ovat ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) kaksi pääalatyyppiä.Erilaiset CT-seulontatestit osoittavat, että adenokarsinooma on yleisin histologinen keuhkosyövän tyyppi1,19,20,21.Tässä tutkimuksessa käytimme ultra-suorituskykyistä nestekromatografiaa ja korkearesoluutioista massaspektrometriaa (UPLC-HRMS) suorittaaksemme metabolomiikka-analyysin yhteensä 695 seeruminäytteelle, mukaan lukien terveet kontrollit, hyvänlaatuiset keuhkokyhmyt ja CT-havaitut ≤3 cm.I vaiheen keuhkojen adenokarsinooman seulonta.Tunnistamme seerumin metaboliittien paneelin, joka erottaa keuhkojen adenokarsinooman hyvänlaatuisista kyhmyistä ja terveistä kontrolleista.Reitin rikastusanalyysi paljasti, että epänormaali tryptofaani- ja glukoosi-aineenvaihdunta ovat yleisiä muutoksia keuhkojen adenokarsinoomassa verrattuna hyvänlaatuisiin kyhmyihin ja terveisiin kontrolleihin.Lopuksi loimme ja validoimme seerumin aineenvaihdunnan luokittelijan, jolla on korkea spesifisyys ja herkkyys erottaaksemme LDCT:llä havaitut pahanlaatuiset ja hyvänlaatuiset keuhkokyhmyt, mikä voi auttaa varhaisessa erotusdiagnoosissa ja riskinarvioinnissa.
Tässä tutkimuksessa sukupuolen ja iän mukaan vastaavat seeruminäytteet otettiin takautuvasti 174 terveeltä kontrollilta, 292 potilaalta, joilla oli hyvänlaatuisia keuhkokyhmyjä, ja 229 potilaalta, joilla oli vaiheen I keuhkojen adenokarsinooma.695 kohteen demografiset ominaisuudet on esitetty lisätaulukossa 1.
Kuten kuvassa 1a esitetään, yhteensä 480 seeruminäytettä, mukaan lukien 174 tervettä kontrollia (HC), 170 hyvänlaatuista kyhmyä (BN) ja 136 vaiheen I keuhkojen adenokarsinooman (LA) näytettä, kerättiin Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskuksessa.Löytökohortti kohdistamattomaan metabolomiseen profilointiin käyttämällä ultra-suorituskykyistä nestekromatografia-korkean resoluution massaspektrometriaa (UPLC-HRMS).Kuten täydentävässä kuvassa 1 näkyy, LA:n ja HC:n, LA:n ja BN:n väliset eroavat metaboliitit tunnistettiin luokittelumallin luomiseksi ja differentiaalireittianalyysin tutkimiseksi.Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskuksen keräämät 104 näytettä ja kahden muun sairaalan keräämät 111 näytettä käytettiin sisäiseen ja ulkoiseen validointiin.
tutkimuspopulaatio löytökohortissa, jolle tehtiin globaali seerumin metabolomiikka-analyysi käyttämällä ultra-suorituskykyistä nestekromatografia-korkean resoluution massaspektrometriaa (UPLC-HRMS).b Osittainen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA) 480 tutkimuskohortin seeruminäytteen kokonaismetaboomista, mukaan lukien terveet kontrollit (HC, n = 174), hyvänlaatuiset kyhmyt (BN, n = 170) ja vaiheen I keuhkojen adenokarsinooma (Los Angeles, n = 136).+ESI, positiivinen sähkösumutusionisaatiotila, -ESI, negatiivinen sähkösumutusionisaatiomoodi.c–e Metaboliitit, joiden runsaudet vaihtelevat merkittävästi kahdessa tietyssä ryhmässä (kaksipyrstöinen Wilcoxon-merkitty järjestystesti, väärän havaitsemisnopeuden mukautettu p-arvo, FDR <0,05) on esitetty punaisena (kertamuutos > 1,2) ja sinisenä (kertamuutos < 0,83). .) näkyy tulivuoren kuvassa.f Hierarkkinen klusterilämpökartta, joka osoittaa merkittäviä eroja annotoitujen metaboliittien määrässä LA:n ja BN:n välillä.Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostoina.
174 HC:n, 170 BN:n ja 136 LA:n seerumin kokonaismetabolomi löytöryhmässä analysoitiin käyttämällä UPLC-HRMS-analyysiä.Osoitamme ensin, että laadunvalvontanäytteet (QC) ryhmittyvät tiukasti valvomattoman pääkomponenttianalyysin (PCA) mallin keskelle, mikä vahvistaa nykyisen tutkimuksen suorituskyvyn vakauden (lisäkuva 2).
Kuten kuvion 1 b osittaisen pienimmän neliösumman erotteluanalyysissä (PLS-DA) näkyy, havaitsimme, että LA:n ja BN:n, LA:n ja HC:n välillä oli selkeitä eroja positiivisissa (+ESI) ja negatiivisissa (-ESI) sähkösumutusionisaatiomuodoissa. .eristetty.Merkittäviä eroja BN:n ja HC:n välillä ei kuitenkaan havaittu +ESI- ja -ESI-olosuhteissa.
Löysimme 382 eroavaa ominaisuutta LA:n ja HC:n välillä, 231 eroavaa ominaisuutta LA:n ja BN:n välillä ja 95 eropiirrettä BN:n ja HC:n välillä (Wilcoxonin signed rank-testi, FDR <0,05 ja moninkertainen muutos >1,2 tai <0,83) (Kuva .1c-e )..Huiput merkittiin edelleen (lisätiedot 3) tietokantaa (mzCloud/HMDB/Chemspider-kirjasto) vastaan m/z-arvon, retentioajan ja fragmentoitumisen massaspektrihaun perusteella (yksityiskohdat on kuvattu osiossa Menetelmät) 22 .Lopuksi tunnistettiin 33 ja 38 annotoitua metaboliittia, joiden runsaudessa oli merkittäviä eroja, LA:lle ja BN:lle (kuva 1f ja täydentävä taulukko 2) ja LA:lle vs. HC:lle (lisäkuva 3 ja lisätaulukko 2).Sitä vastoin vain 3 metaboliittia, joiden runsaudessa oli merkittäviä eroja, tunnistettiin BN:ssä ja HC:ssä (lisätaulukko 2), mikä vastaa BN:n ja HC:n päällekkäisyyttä PLS-DA:ssa.Nämä erilaiset metaboliitit kattavat laajan valikoiman biokemikaaleja (täydentävä kuva 4).Yhdessä nämä tulokset osoittavat merkittäviä muutoksia seerumin metabolomissa, jotka heijastavat varhaisen vaiheen keuhkosyövän pahanlaatuista transformaatiota verrattuna hyvänlaatuisiin keuhkokyhmyihin tai terveisiin koehenkilöihin.Sillä välin BN:n ja HC:n seerumin metabolomin samankaltaisuus viittaa siihen, että hyvänlaatuisilla keuhkokyhmyillä voi olla monia biologisia ominaisuuksia terveiden yksilöiden kanssa.Koska epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (EGFR) geenimutaatiot ovat yleisiä keuhkojen adenokarsinooman alatyypissä 23, pyrimme määrittämään kuljettajamutaatioiden vaikutuksen seerumin metabolomiin.Sitten analysoimme 72 tapauksen yleistä metabolomista profiilia, joilla oli EGFR-status keuhkojen adenokarsinoomaryhmässä.Mielenkiintoista kyllä, löysimme vertailukelpoisia profiileja EGFR-mutanttipotilaiden (n = 41) ja EGFR-villityypin potilaiden (n = 31) välillä PCA-analyysissä (täydentävä kuva 5a).Tunnistamme kuitenkin 7 metaboliittia, joiden runsaus muuttui merkittävästi potilailla, joilla oli EGFR-mutaatio verrattuna potilaisiin, joilla oli villityypin EGFR (t-testi, p < 0,05 ja kertamuutos > 1,2 tai < 0,83) (täydentävä kuva 5b).Suurin osa näistä metaboliiteista (5/7) on asyylikarnitiineja, joilla on tärkeä rooli rasvahappojen hapettumisreiteissä.
Kuten kuvassa 2a esitetyssä työnkulussa havainnollistetaan, biomarkkerit kyhmyjen luokittelua varten saatiin käyttämällä pienimmän absoluuttisen kutistumisen operaattoreita ja valintaa, joka perustui 33 erilaiseen metaboliittiin, jotka tunnistettiin LA:ssa (n = 136) ja BN:ssä (n = 170).Paras muuttujien yhdistelmä (LASSO) – binäärinen logistinen regressiomalli.Kymmenkertaista ristiinvalidointia käytettiin mallin luotettavuuden testaamiseen.Muuttujan valintaa ja parametrien säännöstelyä säädetään todennäköisyyden maksimointirangaistuksella parametrilla λ24.Globaali metabolomiikka-analyysi suoritettiin edelleen itsenäisesti sisäisen validoinnin (n = 104) ja ulkoisen validoinnin (n = 111) ryhmissä erottelumallin luokittelukyvyn testaamiseksi.Tuloksena löytösarjan 27 metaboliittia tunnistettiin parhaaksi erottelumalliksi, jolla on suurin keskimääräinen AUC-arvo (kuvio 2b), joista 9:llä oli lisääntynyt aktiivisuus ja 18:lla alentunut aktiivisuus LA:ssa BN:ään verrattuna (kuvio 2c).
Keuhkokyhmyluokittimen rakentamisen työnkulku, mukaan lukien parhaan seerumin metaboliittien paneelin valitseminen löytöjoukosta käyttämällä binaarista logistista regressiomallia kymmenkertaisen ristiinvalidoinnin avulla ja ennakoivan suorituskyvyn arviointi sisäisissä ja ulkoisissa validointisarjoissa.b LASSO-regressiomallin ristiinvalidointitilastot metabolisen biomarkkerin valinnassa.Yllä annetut numerot edustavat tietyllä λ:lla valittujen biomarkkerien keskimääräistä lukumäärää.Punainen katkoviiva edustaa keskimääräistä AUC-arvoa vastaavalla lambdalla.Harmaat virhepalkit edustavat minimi- ja maksimi AUC-arvoa.Pisteviiva osoittaa parhaan mallin 27 valitulla biomarkkerilla.AUC, vastaanottimen toimintakäyrän (ROC) alla oleva pinta-ala.c Laske 27 valitun metaboliitin muutokset LA-ryhmässä verrattuna BN-ryhmään löytöryhmässä.Punainen sarake – aktivointi.Sininen sarake on lasku.d–f Vastaanottimen toimintaominaisuuksien (ROC) käyrät, jotka osoittavat erottelumallin tehon, joka perustuu 27 metaboliitin yhdistelmään löytö-, sisäisessä ja ulkoisessa validointijoukossa.Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostoina.
Ennustemalli luotiin näiden 27 metaboliitin painotettujen regressiokertoimien perusteella (lisätaulukko 3).Näihin 27 metaboliittiin perustuva ROC-analyysi tuotti käyrän alla olevan alueen (AUC) arvon 0,933, löytöryhmän herkkyys oli 0,868 ja spesifisyys 0,859 (kuvio 2d).Sillä välin LA:n ja HC:n 38 annotoidun metaboliitin joukossa 16 metaboliitin sarja saavutti AUC:n 0,902 herkkyydellä 0,801 ja spesifisyydellä 0,856 LA:n erottamisessa HC:stä (täydentävä kuva 6a-c).Myös AUC-arvoja, jotka perustuivat erilaisten metaboliittien erilaisiin kertamuutoskynnyksiin, verrattiin.Havaitsimme, että luokitusmalli onnistui parhaiten erottelemaan LA:n ja BN:n (HC) välillä, kun kertamuutostaso oli asetettu arvoon 1,2 vs. 1,5 tai 2,0 (lisäkuva 7a, b).Luokittelumalli, joka perustuu 27 metaboliittiryhmään, validoitiin edelleen sisäisissä ja ulkoisissa kohorteissa.AUC oli 0,915 (herkkyys 0,867, spesifisyys 0,811) sisäisessä validoinnissa ja 0,945 (herkkyys 0,810, spesifisyys 0,979) ulkoisessa validoinnissa (kuvio 2e, f).Laboratorioiden välisen tehokkuuden arvioimiseksi ulkopuolisesta kohortista 40 näytettä analysoitiin ulkoisessa laboratoriossa Menetelmät-osiossa kuvatulla tavalla.Luokittelutarkkuus saavutti AUC-arvon 0,925 (lisäkuva 8).Koska keuhkojen okasolusyöpä (LUSC) on ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) toiseksi yleisin alatyyppi keuhkojen adenokarsinooman (LUAD) jälkeen, testasimme myös metabolisten profiilien validoitua mahdollista käyttökelpoisuutta.BN ja 16 LUSC-tapausta.LUSC:n ja BN:n välisen erottelun AUC oli 0,776 (lisäkuva 9), mikä osoittaa heikompaa kykyä verrattuna LUAD:n ja BN:n väliseen erotteluun.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että kyhmyjen koko TT-kuvissa korreloi positiivisesti pahanlaatuisuuden todennäköisyyden kanssa ja on edelleen pääasiallinen kyhmyjen hoidon määräävä tekijä25, 26, 27.NELSON-seulontatutkimuksen laajan kohortin tietojen analyysi osoitti, että pahanlaatuisten kasvainten riski potilailla, joilla oli alle 5 mm solmukohtia, oli jopa samanlainen kuin henkilöillä, joilla ei ollut solmuja 28 .Siksi säännöllistä TT-seurantaa vaativa vähimmäiskoko on British Thoracic Societyn (BTS) suosittelema 5 mm ja Fleischner Societyn suosittelema 6 mm 29 .Kuitenkin yli 6 mm:n kyhmyt, joissa ei ole ilmeisiä hyvänlaatuisia piirteitä, joita kutsutaan määrittelemättömiksi keuhkokyhmyiksi (IPN), ovat edelleen suuri haaste kliinisen käytännön arvioinnissa ja hoidossa30,31.Seuraavaksi tutkimme, vaikuttiko kyhmyn koko metabolomiin allekirjoituksiin käyttämällä yhdistettyjä näytteitä löytö- ja sisäisestä validointikohortista.Keskityen 27 validoituun biomarkkeriin vertailimme ensin HC- ja BN-6 mm:n alapuolella olevien metabolomien PCA-profiileja.Havaitsimme, että useimmat HC:n ja BN:n datapisteet olivat päällekkäisiä, mikä osoittaa, että seerumin metaboliittitasot olivat samanlaiset molemmissa ryhmissä (kuvio 3a).Piirrekartat eri kokoluokissa säilyivät BN:ssä ja LA:ssa (kuvat 3b, c), kun taas pahanlaatuisten ja hyvänlaatuisten kyhmyjen välillä havaittiin ero 6–20 mm:n alueella (kuva 3d).Tämän kohortin AUC oli 0,927, spesifisyys 0,868 ja herkkyys 0,820 6-20 mm:n kyhmyjen pahanlaatuisuuden ennustamiseksi (kuvio 3e, f).Tuloksemme osoittavat, että luokitin voi siepata varhaisen pahanlaatuisen transformaation aiheuttamia metabolisia muutoksia kyhmyn koosta riippumatta.
ad PCA-profiilien vertailu tiettyjen ryhmien välillä 27 metaboliitin metabolisen luokittelun perusteella.CC ja BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.LA:ssa 6–20 mm vs. LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm ja LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Vastaanottimen käyttöominaisuuksien (ROC) käyrä, joka näyttää erottelevan mallin suorituskyvyn kyhmyille 6–20 mm.f Todennäköisyysarvot laskettiin logistisen regressiomallin perusteella 6–20 mm:n kyhmyille.Harmaa katkoviiva edustaa optimaalista raja-arvoa (0,455).Yllä olevat luvut edustavat Los Angelesiin arvioitujen tapausten prosenttiosuutta.Käytä kaksisuuntaista Studentin t-testiä.PCA, pääkomponenttianalyysi.AUC-alue käyrän alla.Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostoina.
Neljä näytettä (44–61-vuotiaat), joiden keuhkojen kyhmyt olivat samankokoisia (7–9 mm), valittiin edelleen havainnollistamaan ehdotetun pahanlaatuisuuden ennustemallin suorituskykyä (kuvat 4a, b).Alkuseulonnassa tapaus 1 esitettiin kiinteänä kyhmynä, jossa oli kalkkeutumista, mikä on hyvänlaatuisuuteen liittyvä ominaisuus, kun taas tapaus 2 esitettiin määrittelemättömänä, osittain kiinteänä kyhmynä ilman ilmeisiä hyvänlaatuisia piirteitä.Kolme seuranta-CT-tutkimusta osoitti, että nämä tapaukset pysyivät vakaina 4 vuoden ajan ja siksi niitä pidettiin hyvänlaatuisina kyhmyinä (kuva 4a).Verrattuna sarja-CT-skannausten kliiniseen arviointiin, yhden otoksen seerumin metaboliittianalyysi nykyisellä luokittelumallilla tunnisti nopeasti ja oikein nämä hyvänlaatuiset kyhmyt todennäköisyysrajoitteiden perusteella (taulukko 1).Kuvassa 4b tapauksen 3 tapauksessa kyhmy, jossa on merkkejä keuhkopussin vetäytymisestä, joka liittyy useimmiten pahanlaatuisuuteen32.Tapaus 4 esitettiin määrittelemättömänä, osittain kiinteänä kyhmynä ilman todisteita hyvänlaatuisesta syystä.Kaikki nämä tapaukset ennustettiin pahanlaatuisiksi luokittelumallin mukaan (taulukko 1).Keuhkojen adenokarsinooman arviointi osoitettiin histopatologisella tutkimuksella keuhkojen resektioleikkauksen jälkeen (kuvio 4b).Ulkoiselle validointisarjalle aineenvaihdunnan luokitin ennusti tarkasti kaksi tapausta, joissa epämääräisiä keuhkojen kyhmyjä oli suurempi kuin 6 mm (lisäkuva 10).
CT-kuvat keuhkojen aksiaalisesta ikkunasta kahdessa hyvänlaatuisessa kyhmytapauksessa.Tapauksessa 1 CT-skannaus 4 vuoden jälkeen osoitti vakaan kiinteän kyhmyn, jonka mitat olivat 7 mm ja kalkkeutumista oikeassa alalohkossa.Tapauksessa 2 CT-skannaus 5 vuoden jälkeen paljasti vakaan, osittain kiinteän kyhmyn, jonka halkaisija oli 7 mm, oikeassa ylälohkossa.b Keuhkojen aksiaaliset ikkuna-CT-kuvat ja vastaavat patologiset tutkimukset kahdesta vaiheen I adenokarsinoomasta ennen keuhkojen resektiota.Tapaus 3 paljasti oikean ylälohkon halkaisijaltaan 8 mm:n kyhmyn, jossa oli keuhkopussin takaisinveto.Tapaus 4 paljasti vasemmassa ylälohkossa 9 mm:n pituisen osittain kiinteän hiotun lasin kyhmyn.Resektoidun keuhkokudoksen hematoksyliini- ja eosiinivärjäys (H&E) (mittakaavapalkki = 50 μm), joka osoittaa keuhkojen adenokarsinooman akinaarisen kasvumallin.Nuolet osoittavat CT-kuvissa havaittuja kyhmyjä.H&E-kuvat ovat edustavia kuvia useista (> 3) mikroskooppisista kentistä, jotka patologi on tutkinut.
Yhdessä tuloksemme osoittavat seerumin metaboliittien biomarkkerien potentiaalisen arvon keuhkokyhmyjen erotusdiagnoosissa, mikä voi aiheuttaa haasteita arvioitaessa TT-seulontaa.
Validoidun differentiaalimetaboliittipaneelin perusteella pyrimme tunnistamaan merkittävien metabolisten muutosten biologiset korrelaatit.MetaboAnalystin KEGG-reitin rikastusanalyysi tunnisti 6 yleistä merkittävästi muuttunutta reittiä kahden tietyn ryhmän välillä (LA vs. HC ja LA vs. BN, säädetty p ≤ 0,001, vaikutus > 0,01).Näille muutoksille oli tunnusomaista häiriöt pyruvaattiaineenvaihdunnassa, tryptofaaniaineenvaihdunnassa, niasiini- ja nikotiiniamidiaineenvaihdunnassa, glykolyysissä, TCA-syklissä ja puriinimetaboliassa (kuvio 5a).Sitten suoritimme edelleen kohdennettua metabolomiikkaa varmistaaksemme suuret muutokset käyttämällä absoluuttista kvantifiointia.Yleisten metaboliittien määrittäminen yleisesti muuttuneilla reiteillä kolminkertaisella kvadrupolimassaspektrometrialla (QQQ) käyttäen autenttisia metaboliittistandardeja.Metabolomiikkatutkimuksen kohdenäytteen demografiset ominaisuudet sisältyvät lisätaulukkoon 4. Globaalien metabolomiikkatulostemme mukaisesti kvantitatiivinen analyysi vahvisti, että hypoksantiini ja ksantiini, pyruvaatti ja laktaatti lisääntyivät LA:ssa BN:ään ja HC:hen verrattuna (kuvat 5b, c, p <0,05).Näissä metaboliiteissa ei kuitenkaan havaittu merkittäviä eroja BN:n ja HC:n välillä.
KEGG-reitin rikastusanalyysi merkittävästi erilaisista metaboliitteista LA-ryhmässä verrattuna BN- ja HC-ryhmiin.Käytettiin kaksisuuntaista Globaltestiä ja p-arvot säädettiin Holm-Bonferroni-menetelmällä (säädetty p ≤ 0,001 ja efektin koko > 0,01).b–d Viulukaaviot, jotka osoittavat hypoksantiini-, ksantiini-, laktaatti-, pyruvaatti- ja tryptofaanitasot seerumin HC-, BN- ja LA-tasoissa LC-MS/MS:llä määritettynä (n = 70 ryhmää kohti).Valkoiset ja mustat katkoviivat osoittavat mediaanin ja kvartiilin, vastaavasti.e Viulun käyrä, joka näyttää SLC7A5:n ja QPRT:n normalisoidun Log2TPM:n (transkriptit miljoonassa) mRNA:n ilmentymisen keuhkojen adenokarsinoomassa (n = 513) verrattuna normaaliin keuhkokudokseen (n = 59) LUAD-TCGA-aineistossa.Valkoinen laatikko edustaa kvartiiliväliä, horisontaalinen musta viiva keskellä edustaa mediaania ja pystysuora musta viiva, joka ulottuu laatikosta, edustaa 95 %:n luottamusväliä (CI).f Pearsonin korrelaatiokäyrä SLC7A5:n ja GAPDH:n ilmentymisestä keuhkojen adenokarsinoomassa (n = 513) ja normaalissa keuhkokudoksessa (n = 59) TCGA-aineistossa.Harmaa alue edustaa 95 % CI:tä.r, Pearson-korrelaatiokerroin.g Normalisoidut solutryptofaanitasot A549-soluissa, jotka on transfektoitu epäspesifisellä shRNA-kontrollilla (NC) ja shSLC7A5:llä (Sh1, Sh2), määritetty LC-MS/MS:llä.Jokaisessa ryhmässä esitetään viiden biologisesti riippumattoman näytteen tilastollinen analyysi.h NADt:n solutasot (kokonais-NAD, mukaan lukien NAD+ ja NADH) A549-soluissa (NC) ja SLC7A5-knockdown-A549-soluissa (Sh1, Sh2).Jokaisessa ryhmässä esitetään kolmen biologisesti riippumattoman näytteen tilastollinen analyysi.i A549-solujen glykolyyttinen aktiivisuus ennen ja jälkeen SLC7A5-knockdownin mitattiin ekstrasellulaarisella happamoitumisnopeudella (ECAR) (n = 4 biologisesti riippumatonta näytettä ryhmää kohden).2-DG,2-deoksi-D-glukoosi.Kaksisuuntaista Studentin t-testiä käytettiin kohdassa (b–h).Kohdassa (g–i) virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD, jokainen koe suoritettiin kolme kertaa itsenäisesti ja tulokset olivat samanlaisia.Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostoina.
Ottaen huomioon muuttuneen tryptofaaniaineenvaihdunnan merkittävän vaikutuksen LA-ryhmässä, arvioimme myös seerumin tryptofaanitasoja HC-, BN- ja LA-ryhmissä käyttämällä QQQ:ta.Havaitsimme, että seerumin tryptofaani väheni LA:ssa verrattuna HC:hen tai BN:ään (p < 0,001, kuva 5d), mikä on yhdenmukainen aiempien havaintojen kanssa, joiden mukaan verenkierron tryptofaanitasot ovat alhaisemmat keuhkosyöpäpotilailla kuin terveillä kontrolliryhmän verrokeilla33, 34. ,35.Toisessa tutkimuksessa, jossa käytettiin PET/CT-merkkiainetta 11C-metyyli-L-tryptofaania, havaittiin, että tryptofaanisignaalin retentioaika keuhkosyöpäkudoksessa oli merkittävästi pidentynyt verrattuna hyvänlaatuisiin leesioihin tai normaaliin kudokseen36.Oletamme, että tryptofaanin väheneminen LA-seerumissa voi heijastaa keuhkosyöpäsolujen aktiivista tryptofaanin ottoa.
Tiedetään myös, että tryptofaanin katabolismin kinureniinireitin lopputuote on NAD+37,38, joka on tärkeä substraatti glykolyysissä glykolyysissä tapahtuvalle glyseraldehydi-3-fosfaatin reaktiolle 1,3-bisfosfoglyseraatin kanssa39.Vaikka aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet tryptofaanin katabolismin rooliin immuunisäätelyssä, pyrimme selvittämään tryptofaanin dysregulaation ja nykyisessä tutkimuksessa havaittujen glykolyyttisten reittien välistä vuorovaikutusta.Liuenneen aineen kuljettajaperheen 7 jäsenen 5 (SLC7A5) tiedetään olevan tryptofaanin kuljettaja43,44,45.Kinoliinihappofosforibosyylitransferaasi (QPRT) on entsyymi, joka sijaitsee alavirtaan kinureniinireitistä, joka muuttaa kinoliinihapon NAMN46:ksi.LUAD TCGA -tietojoukon tarkastelu paljasti, että sekä SLC7A5 että QPRT olivat merkittävästi lisääntyneet kasvainkudoksessa normaaliin kudokseen verrattuna (kuvio 5e).Tämä lisääntyminen havaittiin keuhkojen adenokarsinooman I ja II sekä vaiheissa III ja IV (täydentävä kuva 11), mikä osoittaa varhaisia häiriöitä tryptofaanin aineenvaihdunnassa, jotka liittyvät tuumorigeneesiin.
Lisäksi LUAD-TCGA-aineisto osoitti positiivisen korrelaation SLC7A5:n ja GAPDH:n mRNA:n ilmentymisen välillä syöpäpotilasnäytteissä (r = 0,45, p = 1,55E-26, kuva 5f).Sitä vastoin ei havaittu merkittävää korrelaatiota tällaisten geenien allekirjoitusten välillä normaalissa keuhkokudoksessa (r = 0,25, p = 0,06, kuvio 5f).SLC7A5:n tuhoutuminen (täydentävä kuva 12) A549-soluissa vähensi merkittävästi solujen tryptofaani- ja NAD(H)-tasoja (kuvio 5g, h), mikä johti heikentyneeseen glykolyyttiseen aktiivisuuteen mitattuna solunulkoisella happamoitumisnopeudella (ECAR) (kuva 1).5i).Siten seerumin metabolisten muutosten ja in vitro -detektion perusteella oletamme, että tryptofaaniaineenvaihdunta voi tuottaa NAD+:a kinureniinireitin kautta ja sillä on tärkeä rooli glykolyysin edistämisessä keuhkosyövässä.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että suuri määrä LDCT:llä havaittuja määrittelemättömiä keuhkokyhmyjä voi johtaa lisätestien, kuten PET-CT:n, keuhkobiopsian ja ylihoidon tarpeeseen, koska pahanlaatuisuus on väärä positiivinen diagnoosi.31 Kuten kuvasta 6, tutkimuksemme tunnisti paneelin seerumin metaboliitteja, joilla on potentiaalista diagnostista arvoa ja jotka voivat parantaa riskien kerrostumista ja myöhempää TT:llä havaittujen keuhkojen kyhmyjen hallintaa.
Keuhkojen kyhmyt arvioidaan käyttämällä pienen annoksen tietokonetomografiaa (LDCT), jossa kuvantamisominaisuudet viittaavat hyvänlaatuisiin tai pahanlaatuisiin syihin.Epävarma kyhmyjen lopputulos voi johtaa toistuviin seurantakäynteihin, tarpeettomiin interventioihin ja ylihoitoon.Diagnostista arvoa omaavien seerumin aineenvaihdunnan luokittimien sisällyttäminen voi parantaa riskin arviointia ja myöhempää keuhkokyhmyjen hallintaa.PET positroniemissiotomografia.
Yhdysvaltain NLST-tutkimuksen ja eurooppalaisen NELSON-tutkimuksen tiedot viittaavat siihen, että korkean riskin ryhmien seulonta pieniannoksisella tietokonetomografialla (LDCT) voi vähentää keuhkosyöpäkuolleisuutta1,3.LDCT:llä havaittujen suuren määrän satunnaisten keuhkokyhmyjen riskinarviointi ja myöhempi kliininen hallinta ovat kuitenkin edelleen haastavinta.Päätavoitteena on optimoida olemassa olevien LDCT-pohjaisten protokollien oikea luokittelu käyttämällä luotettavia biomarkkereita.
Tietyt molekyylibiomarkkerit, kuten veren aineenvaihduntatuotteet, on tunnistettu vertaamalla keuhkosyöpää terveisiin kontrolleihin15,17.Tässä tutkimuksessa keskityimme seerumin metabolomiikan analyysin soveltamiseen erottaaksemme LDCT:llä sattumanvaraisesti havaitut hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset keuhkokyhmyt.Vertailimme terveen kontrollin (HC), hyvänlaatuisten keuhkojen kyhmyjen (BN) ja vaiheen I keuhkojen adenokarsinoomanäytteiden (LA) globaalia seerumin metabolomia käyttämällä UPLC-HRMS-analyysiä.Havaitsimme, että HC:llä ja BN:llä oli samanlaiset metaboliset profiilit, kun taas LA osoitti merkittäviä muutoksia verrattuna HC:hen ja BN:ään.Tunnistamme kaksi sarjaa seerumin metaboliitteja, jotka erottavat LA:n HC:stä ja BN:stä.
Nykyinen LDCT-pohjainen hyvänlaatuisten ja pahanlaatuisten kyhmyjen tunnistusjärjestelmä perustuu pääasiassa kyhmyjen kokoon, tiheyteen, morfologiaan ja kasvunopeuteen ajan kuluessa30.Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kyhmyjen koko liittyy läheisesti keuhkosyövän todennäköisyyteen.Jopa suuren riskin potilailla pahanlaatuisuuden riski alle 6 mm:n solmuissa on <1 %.Pahanlaatuisuuden riski 6–20 mm:n kyhmyille vaihtelee 8–64 %30.Siksi Fleischner Society suosittelee 6 mm:n rajahalkaisijaa rutiininomaiseen CT-seurantaan.29 Yli 6 mm:n mittaisten määrittämättömien keuhkokyhmyjen (IPN) riskinarviointia ja hallintaa ei kuitenkaan ole suoritettu riittävästi 31 .Synnynnäisen sydänsairauden nykyinen hoito perustuu yleensä tarkkaavaiseen odottamiseen ja säännölliseen TT-seurantaan.
Validoidun metabolomin perusteella osoitimme ensimmäistä kertaa metabolomien allekirjoitusten päällekkäisyyden terveiden yksilöiden ja hyvänlaatuisten <6 mm:n kyhmyjen välillä.Biologinen samankaltaisuus on yhdenmukainen aiempien TT-löydösten kanssa, joiden mukaan <6 mm:n kyhmyjen pahanlaatuisuuden riski on yhtä alhainen kuin koehenkilöillä, joilla ei ole solmua.30 On huomattava, että tuloksemme osoittavat myös, että hyvänlaatuiset kyhmyt <6 mm ja ≥6 mm ovat korkeat. samankaltaisuus metabolomissa profiileissa, mikä viittaa siihen, että hyvänlaatuisen etiologian toiminnallinen määritelmä on johdonmukainen kyhmyn koosta riippumatta.Siten nykyaikaiset diagnostiset seerumin metaboliittipaneelit voivat tarjota yksittäisen määrityksen poissulkemistestinä, kun kyhmyjä havaitaan alun perin TT:ssä, ja se saattaa vähentää sarjaseurantaa.Samanaikaisesti sama metabolisten biomarkkereiden paneeli erotti pahanlaatuiset kyhmyt, joiden koko oli ≥6 mm, hyvänlaatuisista kyhmyistä ja tarjosi tarkat ennusteet samankokoisille IPN:ille ja moniselitteisille morfologisille piirteille TT-kuvissa.Tämä seerumin aineenvaihdunnan luokitin suoriutui hyvin ennustettaessa ≥6 mm:n kyhmyjen pahanlaatuisuutta AUC-arvon ollessa 0,927.Yhdessä tuloksemme osoittavat, että ainutlaatuiset seerumin metabolomiset allekirjoitukset voivat spesifisesti heijastaa varhaisia kasvaimen aiheuttamia metabolisia muutoksia ja niillä voi olla potentiaalista arvoa riskin ennustajina kyhmyn koosta riippumatta.
Erityisesti keuhkojen adenokarsinooma (LUAD) ja okasolusyöpä (LUSC) ovat ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) päätyypit.Koska LUSC liittyy vahvasti tupakan käyttöön47 ja LUAD on yleisin CT-seulonnassa havaittujen satunnaisten keuhkojen kyhmyjen histologia48, luokittelumallimme rakennettiin erityisesti vaiheen I adenokarsinoomanäytteitä varten.Wang ja kollegat keskittyivät myös LUADiin ja tunnistivat yhdeksän lipidisignatuuria käyttämällä lipidomiikkaa erottaakseen varhaisen vaiheen keuhkosyövän terveistä yksilöistä17.Testasimme nykyistä luokittelumallia 16:ssa vaiheen I LUSC-tapauksessa ja 74 hyvänlaatuisessa kyhmyssä ja havaitsimme alhaisen LUSC-ennustetarkkuuden (AUC 0,776), mikä viittaa siihen, että LUAD:lla ja LUSC:llä voi olla omat metabolomiset allekirjoituksensa.Itse asiassa LUAD:n ja LUSC:n on osoitettu eroavan toisistaan etiologiassa, biologisessa alkuperässä ja geneettisissä poikkeavuuksissa49.Siksi muun tyyppiset histologiat tulisi sisällyttää koulutusmalleihin keuhkosyövän populaatiopohjaisessa havaitsemisessa seulontaohjelmissa.
Tässä tunnistimme kuusi yleisimmin muuttunutta reittiä keuhkojen adenokarsinoomassa verrattuna terveisiin kontrolleihin ja hyvänlaatuisiin kyhmyihin.Ksantiini ja hypoksantiini ovat tavallisia puriinien aineenvaihduntareitin metaboliitteja.Tulostemme mukaisesti puriinimetaboliaan liittyvät välituotteet lisääntyivät merkittävästi keuhkojen adenokarsinoomapotilaiden seerumissa tai kudoksissa verrattuna terveisiin kontrolleihin tai preinvasiivisessa vaiheessa oleviin potilaisiin15,50.Kohonneet seerumin ksantiini- ja hypoksantiinitasot voivat heijastaa nopeasti lisääntyvien syöpäsolujen vaatimaa anaboliaa.Glukoosiaineenvaihdunnan häiriöt on tunnettu syövän aineenvaihdunnan tunnusmerkki51.Tässä havaitsimme pyruvaatin ja laktaatin merkittävän nousun LA-ryhmässä verrattuna HC- ja BN-ryhmään, mikä on yhdenmukainen aiempien raporttien kanssa glykolyyttisen reitin poikkeavuuksista ei-pienisoluista keuhkosyöpää (NSCLC) sairastavien potilaiden seerumin metabolomiprofiileissa. terveet kontrollit.tulokset ovat johdonmukaisia52,53.
Tärkeää on, että havaitsimme käänteisen korrelaation pyruvaatin ja tryptofaanin aineenvaihdunnan välillä keuhkojen adenokarsinoomien seerumissa.Seerumin tryptofaanitasot laskivat LA-ryhmässä verrattuna HC- tai BN-ryhmään.Mielenkiintoista on, että aikaisemmassa laajamittaisessa tutkimuksessa, jossa käytettiin tulevaa kohorttia, havaittiin, että verenkierrossa olevan tryptofaanin alhaiset tasot liittyivät lisääntyneeseen keuhkosyövän riskiin 54 .Tryptofaani on välttämätön aminohappo, jonka saamme kokonaan ruoasta.Päättelemme, että seerumin tryptofaanin väheneminen keuhkojen adenokarsinoomassa voi heijastaa tämän metaboliitin nopeaa ehtymistä.On hyvin tunnettua, että tryptofaanin katabolismin lopputuote kinureniinireitin kautta on de novo NAD+ -synteesin lähde.Koska NAD+:a tuotetaan ensisijaisesti pelastusreitin kautta, NAD+:n merkitys tryptofaaniaineenvaihdunnassa terveydelle ja sairauksille on vielä määrittämättä46.Analyysimme TCGA-tietokannasta osoitti, että tryptofaanin kuljettajan liuenneen aineen kuljettajan 7A5 (SLC7A5) ilmentyminen lisääntyi merkittävästi keuhkojen adenokarsinoomassa verrattuna normaaleihin kontrolleihin ja korreloi positiivisesti glykolyyttisen entsyymin GAPDH:n ilmentymisen kanssa.Aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet pääasiassa tryptofaanin katabolismin rooliin tuumorinvastaisen immuunivasteen tukahduttamisessa40, 41, 42.Tässä osoitamme, että tryptofaanin sisäänoton estäminen SLC7A5:n kaatumisesta keuhkosyöpäsoluissa johtaa myöhempään solujen NAD-tasojen laskuun ja samanaikaiseen glykolyyttisen aktiivisuuden heikkenemiseen.Yhteenvetona tutkimuksemme tarjoaa biologisen perustan seerumin aineenvaihdunnan muutoksille, jotka liittyvät keuhkojen adenokarsinooman pahanlaatuiseen transformaatioon.
EGFR-mutaatiot ovat yleisimpiä kuljettajamutaatioita potilailla, joilla on NSCLC.Tutkimuksessamme havaitsimme, että potilailla, joilla oli EGFR-mutaatio (n = 41), yleinen metabolominen profiili oli samanlainen kuin potilailla, joilla oli villityypin EGFR (n = 31), vaikka havaitsimme joidenkin EGFR-mutanttipotilaiden seerumipitoisuudet asyylikarnitiinipotilailla.Asyylikarnitiinien vakiintunut tehtävä on kuljettaa asyyliryhmiä sytoplasmasta mitokondriomatriisiin, mikä johtaa rasvahappojen hapettumiseen energian tuottamiseksi 55 .Löydöstemme mukaisesti äskettäisessä tutkimuksessa tunnistettiin myös samanlaiset metabolomiprofiilit EGFR-mutanttien ja EGFR-villityypin kasvainten välillä analysoimalla 102 keuhkojen adenokarsinoomakudosnäytteen50 globaalia metabolomia.Mielenkiintoista on, että asyylikarnitiinipitoisuus löydettiin myös EGFR-mutanttiryhmästä.Siksi, heijastavatko muutokset asyylikarnitiinitasoissa EGFR:n aiheuttamia metabolisia muutoksia ja taustalla olevia molekyylireittejä, saattaa olla tarpeen tutkia lisätutkimuksia.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme perustaa seerumin aineenvaihdunnan luokittelijan keuhkojen kyhmyjen erotusdiagnoosille ja ehdottaa työnkulkua, joka voi optimoida riskinarvioinnin ja helpottaa CT-skannausseulontaan perustuvaa kliinistä hallintaa.
Tämän tutkimuksen hyväksyivät Sun Yat-senin yliopistollisen syöpäsairaalan eettinen komitea, Sun Yat-senin yliopiston ensimmäinen sidossairaala ja Zhengzhoun yliopistollisen syöpäsairaalan eettinen komitea.Löytö- ja sisäisissä validointiryhmissä kerättiin 174 seerumia terveiltä yksilöiltä ja 244 seerumia hyvänlaatuisista kyhmyistä henkilöiltä, joille tehtiin vuotuiset lääketieteelliset tarkastukset Sun Yat-senin yliopiston syövän hallinnan ja ehkäisyn osastolla, ja 166 hyvänlaatuista kyhmyä.seerumi.Vaiheen I keuhkojen adenokarsinoomat kerättiin Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskuksesta.Ulkoisessa validointikohortissa oli 48 tapausta hyvänlaatuisia kyhmyjä, 39 tapausta vaiheen I keuhkojen adenokarsinoomasta Sun Yat-senin yliopiston ensimmäisestä liitännäissairaalasta ja 24 tapausta I vaiheen keuhkojen adenokarsinoomasta Zhengzhoun syöpäsairaalasta.Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskus keräsi myös 16 I vaiheen okasolukeuhkosyövän tapausta testatakseen vakiintuneen aineenvaihdunnan luokittelijan diagnostista kykyä (potilaan ominaisuudet on esitetty lisätaulukossa 5).Näytteet löytökohortista ja sisäisestä validointikohortista kerättiin tammikuun 2018 ja toukokuun 2020 välisenä aikana. Näytteet ulkoista validointikohorttia varten kerättiin elokuun 2021 ja lokakuun 2022 välisenä aikana. Sukupuoliharhan minimoimiseksi kullekin kohdistettiin suunnilleen sama määrä miesten ja naisten tapauksia. kohortti.Discovery Team ja Internal Review Team.Osallistujan sukupuoli määritettiin itseraportin perusteella.Kaikilta osallistujilta saatiin tietoinen suostumus, eikä korvausta maksettu.Koehenkilöt, joilla oli hyvänlaatuisia kyhmyjä, olivat sellaisia, joiden CT-skannauspistemäärä oli vakaa 2–5 vuoden kohdalla analyysin aikaan, lukuun ottamatta yhtä tapausta ulkoisesta validointinäytteestä, joka kerättiin ennen leikkausta ja diagnosoitiin histopatologialla.Lukuun ottamatta kroonista keuhkoputkentulehdusta.Keuhkojen adenokarsinoomatapaukset kerättiin ennen keuhkojen resektiota ja vahvistettiin patologisella diagnoosilla.Paastoverinäytteet kerättiin seerumin erotusputkiin ilman mitään antikoagulantteja.Verinäytteitä hyydytettiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sentrifugoitiin sitten 2851 x g:ssä 10 minuuttia 4 °C:ssa seerumin supernatantin keräämiseksi.Seerumierät jäädytettiin -80 °C:ssa metaboliitin uuttamiseen asti.Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskuksen syövänehkäisyn ja lääketieteellisen tutkimuksen osasto keräsi seerumipoolin 100 terveeltä luovuttajalta, mukaan lukien yhtä monta 40–55-vuotiaista miehiä ja naisia.Yhtä suuret tilavuudet kutakin luovuttajanäytettä sekoitettiin, saatu pooli jaettiin eriin ja säilytettiin -80 °C:ssa.Seerumiseosta käytettiin vertailumateriaalina laadunvalvonnassa ja tietojen standardoinnissa.
Referenssiseerumi ja testinäytteet sulatettiin ja metaboliitit uutettiin käyttämällä yhdistettyä uuttomenetelmää (MTBE/metanoli/vesi)56.Lyhyesti sanottuna 50 μl seerumia sekoitettiin 225 μl:aan jääkylmää metanolia ja 750 μl:aan jääkylmää metyyli-tert-butyylieetteriä (MTBE).Sekoita seosta ja inkuboi jäillä 1 tunti.Sitten näytteet sekoitettiin ja vortex-sekoitettiin 188 µl:aan MS-luokan vettä, joka sisälsi sisäisiä standardeja (13C-laktaatti, 13C3-pyruvaatti, 13C-metioniini ja 13C6-isoleusiini, ostettu Cambridge Isotope Laboratoriesilta).Seosta sentrifugoitiin sitten nopeudella 15 000 x g 10 minuuttia 4 °C:ssa, ja alempi faasi siirrettiin kahteen putkeen (kumpikin 125 µl) LC-MS-analyysiä varten positiivisissa ja negatiivisissa tiloissa.Lopuksi näyte haihdutettiin kuiviin nopeassa tyhjiökonsentraattorissa.
Kuivatut metaboliitit liuotettiin 120 μl:aan 80-prosenttista asetonitriiliä, vorteksoitiin 5 minuuttia ja sentrifugoitiin 15 000 × g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa.Supernatantit siirrettiin kullanruskeisiin lasipulloihin, joissa oli mikroinsertit metabolomiikkatutkimuksia varten.Kohdistamaton metabolomiikka-analyysi ultra-suorituskykyisellä nestekromatografia-korkean resoluution massaspektrometrialla (UPLC-HRMS) -alustalla.Metaboliitit erotettiin käyttämällä Dionex Ultimate 3000 UPLC -järjestelmää ja ACQUITY BEH Amide -kolonnia (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Positiivisessa ionitilassa liikkuvat faasit olivat 95 % (A) ja 50 % asetonitriiliä (B), joista kukin sisälsi 10 mmol/l ammoniumasetaattia ja 0,1 % muurahaishappoa.Negatiivisessa tilassa liikkuvat faasit A ja B sisälsivät 95 % ja B 50 % asetonitriiliä, molemmat faasit sisälsivät 10 mmol/L ammoniumasetaattia, pH = 9. Gradienttiohjelma oli seuraava: 0-0,5 min, 2 % B;0,5–12 min, 2–50 % B;12–14 min, 50–98 % B;14–16 min, 98 % B;16-16.1.min, 98-2 % B;16,1-20 min, 2 % B. Pylvästä pidettiin 40 °C:ssa ja näytettä 10 °C:ssa automaattisessa näytteenottimessa.Virtausnopeus oli 0,3 ml/min, injektiotilavuus 3 μl.Q-Exactive Orbitrap -massaspektrometri (Thermo Fisher Scientific), jossa oli sähkösumutusionisaatio (ESI) -lähde, käytettiin täydessä pyyhkäisytilassa ja yhdistetty ddMS2-valvontamoodiin suurten tietomäärien keräämiseksi.MS-parametrit asetettiin seuraavasti: suihkujännite +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillaarilämpötila 320°C, suojakaasu 40 arb, apukaasu 10 arb, anturin lämmittimen lämpötila 350°C, skannausalue 70-1050 m/h, resoluutio.70 000. Tiedot hankittiin käyttämällä Xcalibur 4.1:tä (Thermo Fisher Scientific).
Tietojen laadun arvioimiseksi luotiin yhdistetyt laadunvalvontanäytteet (QC) poistamalla kustakin näytteestä 10 µl:n eriä supernatanttia.Kuusi laadunvalvontanäyteinjektiota analysoitiin analyyttisen sekvenssin alussa UPLC-MS-järjestelmän stabiilisuuden arvioimiseksi.Laadunvalvontanäytteet tuodaan sitten ajoittain erään.Kaikki tämän tutkimuksen 11 seeruminäyteerää analysoitiin LC-MS:llä.Alikvootteja seerumipooliseoksesta 100 terveeltä luovuttajalta käytettiin vertailumateriaalina vastaavissa erissä uuttoprosessin seuraamiseksi ja erien välisten vaikutusten säätämiseksi.Löytökohortin, sisäisen validointikohortin ja ulkoisen validointikohortin kohdistamaton metabolomiikka-analyysi suoritettiin Sun Yat-senin yliopiston Metabolomiikkakeskuksessa.Guangdongin teknillisen yliopiston analyysi- ja testauskeskuksen ulkopuolinen laboratorio analysoi myös 40 näytettä ulkoisesta kohortista testatakseen luokitinmallin suorituskykyä.
Uuton ja uudelleenmuodostuksen jälkeen seerumin metaboliittien absoluuttinen kvantifiointi mitattiin käyttämällä ultrakorkeaa suorituskykyä nestekromatografia-tandem-massaspektrometriaa (Agilent 6495 triple kvadrupoli) sähkösumutusionisaatiolähteellä (ESI) usean reaktion monitorointitilassa (MRM).ACQUITY BEH Amidikolonnia (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) käytettiin metaboliittien erottamiseen.Liikkuva faasi koostui 90 %:sta (A) ja 5 % asetonitriilistä (B), jossa oli 10 mmol/l ammoniumasetaattia ja 0,1 % ammoniakkiliuosta.Gradienttiohjelma oli seuraava: 0–1,5 min, 0 % B;1,5–6,5 min, 0–15 % B;6,5–8 min, 15 % B;8–8,5 min, 15–0 % B;8,5–11,5 min, 0 %B.Pylväs pidettiin 40 °C:ssa ja näytettä 10 °C:ssa automaattisessa näytteenottimessa.Virtausnopeus oli 0,3 ml/min ja injektiotilavuus 1 µl.MS-parametrit asetettiin seuraavasti: kapillaarijännite ±3,5 kV, sumuttimen paine 35 psi, vaippakaasun virtaus 12 l/min, vaippakaasun lämpötila 350 °C, kuivauskaasun lämpötila 250 °C ja kuivauskaasun virtaus 14 l/min.Tryptofaanin, pyruvaatin, laktaatin, hypoksantiinin ja ksantiinin MRM-konversiot olivat 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 ja 151,0–107.9 vastaavasti.Tiedot kerättiin käyttämällä Mass Hunter B.07.00:aa (Agilent Technologies).Seeruminäytteitä varten tryptofaani, pyruvaatti, laktaatti, hypoksantiini ja ksantiini määritettiin käyttämällä standardiseosliuosten kalibrointikäyriä.Solunäytteiden tryptofaanipitoisuus normalisoitiin sisäiseen standardiin ja soluproteiinimassaan.
Huippuuutto (m/z ja retentioaika (RT)) suoritettiin käyttämällä yhdistettä Discovery 3.1 ja TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Erien välisten mahdollisten erojen eliminoimiseksi testinäytteen kukin ominaispiikki jaettiin saman erän vertailumateriaalin tunnusomaisella huipulla suhteellisen runsauden saamiseksi.Sisäisten standardien suhteelliset standardipoikkeamat ennen standardointia ja sen jälkeen on esitetty lisätaulukossa 6. Kahden ryhmän välisille eroille oli tunnusomaista väärien löydösten määrä (FDR < 0,05, Wilcoxon signed rank test) ja kertamuutos (> 1,2 tai < 0,83).Poistettujen ominaisuuksien raaka-MS-tiedot ja seerumikorjatut MS-tiedot esitetään lisätiedoissa 1 ja lisätiedoissa 2.Huippumerkintä suoritettiin neljän määritellyn tunnistustason perusteella, mukaan lukien tunnistetut metaboliitit, oletetut annotoidut yhdisteet, oletetut yhdisteluokat ja tuntemattomat yhdisteet 22 .Compound Discovery 3.1:ssä (mzCloud, HMDB, Chemspider) tehtyjen tietokantahakujen perusteella biologiset yhdisteet, joiden MS/MS vastasi validoituja standardeja tai tarkan vastaavuuden annotaatioita mzCloudissa (pistemäärä > 85) tai Chemspiderissä, valittiin lopulta välituotteiksi differentiaalisen metabolomin välillä.Jokaisen ominaisuuden huippumerkinnät sisältyvät lisätietoihin 3. MetaboAnalyst 5.0:aa käytettiin summanormalisoitujen metaboliittien runsauden yksimuuttujaanalyysiin.MetaboAnalyst 5.0 arvioi myös KEGG-reitin rikastusanalyysin, joka perustui merkittävästi erilaisiin metaboliitteihin.Pääkomponenttianalyysi (PCA) ja osittaisten pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA) analysoitiin käyttämällä ropls-ohjelmistopakettia (v.1.26.4) pinon normalisoinnin ja automaattisen skaalauksen kanssa.Optimaalinen metaboliitin biomarkkerimalli kyhmyn pahanlaatuisuuden ennustamiseen luotiin käyttämällä binaarista logistista regressiota, jossa oli pienin absoluuttinen kutistuminen ja valintaoperaattori (LASSO, R-paketti v.4.1-3).Diskriminanttimallin suorituskykyä havainnointi- ja validointisarjoissa karakterisoitiin arvioimalla AUC ROC-analyysin perusteella pROC-paketin (v.1.18.0.) mukaisesti.Optimaalinen todennäköisyysraja saatiin mallin maksimi Youden-indeksin perusteella (herkkyys + spesifisyys – 1).Näytteet, joiden arvot ovat pienempiä tai suurempia kuin kynnysarvo, ennustetaan hyvänlaatuisiksi kyhmyiksi ja keuhkojen adenokarsinoomaksi.
A549-soluja (#CCL-185, American Type Culture Collection) kasvatettiin F-12K-elatusaineessa, joka sisälsi 10 % FBS:ää.Lyhyet hiusneula-RNA (shRNA) -sekvenssit, jotka kohdistuivat SLC7A5:een, ja nontargeting kontrolli (NC) insertoitiin lentivirusvektoriin pLKO.1-puro.shSLC7A5:n antisense-sekvenssit ovat seuraavat: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Vasta-aineet SLC7A5:lle (#5347) ja tubuliinille (#2148) ostettiin Cell Signaling Technologylta.Vasta-aineita SLC7A5:tä ja tubuliinia vastaan käytettiin laimennoksessa 1:1000 Western blot -analyysiin.
Seahorse XF Glycolytic Stress Test mittaa solunulkoisen happamoitumisen (ECAR) tasoa.Määrityksessä glukoosia, oligomysiini A:ta ja 2-DG:tä annettiin peräkkäin solun glykolyyttisen kapasiteetin testaamiseksi ECAR:lla mitattuna.
A549-solut, jotka oli transfektoitu ei-kohdentavalla kontrollilla (NC) ja shSLC7A5:llä (Sh1, Sh2), maljattiin yön yli halkaisijaltaan 10 cm:n maljoille.Solujen metaboliitit uutettiin 1 ml:lla jääkylmää 80-prosenttista vesipitoista metanolia.Metanoliliuoksessa olevat solut kaavittiin pois, kerättiin uuteen putkeen ja sentrifugoitiin 15 000 x g:ssä 15 minuuttia 4 °C:ssa.Kerää 800 µl supernatanttia ja kuivaa käyttämällä nopeaa tyhjiökonsentraattoria.Kuivatut metaboliittipelletit analysoitiin sitten tryptofaanitasojen suhteen käyttämällä LC-MS/MS:ää edellä kuvatulla tavalla.Solujen NAD(H)-tasot A549-soluissa (NC ja shSLC7A5) mitattiin käyttämällä kvantitatiivista NAD+/NADH-kolorimetristä kittiä (#K337, BioVision) valmistajan ohjeiden mukaisesti.Proteiinitasot mitattiin jokaisesta näytteestä metaboliittien määrän normalisoimiseksi.
Otoskoon alustavaan määrittämiseen ei käytetty tilastollisia menetelmiä.Aiempia biomarkkerien löytämiseen tähtääviä metabolomiikkatutkimuksia15,18 on pidetty koon määrityksen vertailuarvoina, ja näihin raportteihin verrattuna otoksemme oli riittävä.Yhtään näytettä ei jätetty pois tutkimuskohortista.Seeruminäytteet jaettiin satunnaisesti löytöryhmään (306 tapausta, 74,6 %) ja sisäiseen validointiryhmään (104 tapausta, 25,4 %) kohdentamattomia metabolomiikkatutkimuksia varten.Valitsimme myös satunnaisesti 70 tapausta kustakin ryhmästä kohdennettujen metabolomiikkatutkimusten löytöjoukosta.Tutkijat sokeutuivat ryhmien jakamiseen LC-MS-tietojen keruun ja analyysin aikana.Metabolian datan tilastolliset analyysit ja solukokeet on kuvattu vastaavissa Tulokset-, Kuvaselitteet- ja Menetelmät-osioissa.Solujen tryptofaanin, NADT:n ja glykolyyttisen aktiivisuuden kvantifiointi suoritettiin kolme kertaa itsenäisesti identtisin tuloksin.
Lisätietoja tutkimuksen suunnittelusta on tähän artikkeliin liittyvässä Natural Portfolio -raportin tiivistelmässä.
Poistettujen ominaisuuksien raaka-MS-tiedot ja vertailuseerumin normalisoidut MS-tiedot on esitetty lisätiedoissa 1 ja lisätiedoissa 2.Erotusominaisuuksien huippumerkinnät on esitetty lisätiedoissa 3. LUAD TCGA -tietojoukko voidaan ladata osoitteesta https://portal.gdc.cancer.gov/.Syöttötiedot kaavion piirtämistä varten ovat lähdetiedoissa.Tämän artikkelin lähdetiedot on annettu.
National Lung Screening Study Group jne. Keuhkosyöpäkuolleisuuden vähentäminen pieniannoksisella tietokonetomografialla.Pohjois-Englannissa.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ja Prophet, PC Keuhkosyövän seulonta pieniannoksisella helikaalisella CT:llä: tulokset National Lung Screening Study (NLST) -tutkimuksesta.J. Med.Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et ai.Keuhkosyöpäkuolleisuuden vähentäminen volumetrisellä CT-seulonnalla satunnaistetussa tutkimuksessa.Pohjois-Englannissa.J. Med.382, 503–513 (2020).
Postitusaika: 18.9.2023