Tietokonetomografialla (TT) tunnistettujen keuhkokyhmyjen erotusdiagnoosi on edelleen haaste kliinisessä käytännössä. Tässä tutkimuksessa karakterisoimme 480 seeruminäytteen globaalin metabolomin, mukaan lukien terveet verrokit, hyvänlaatuiset keuhkokyhmyt ja vaiheen I keuhkoadenokarsinooma. Adenokarsinoomilla on ainutlaatuiset metabolomiprofiilit, kun taas hyvänlaatuisilla kyhmyillä ja terveillä yksilöillä on suuri samankaltaisuus metabolomiprofiileissa. Löytöryhmässä (n = 306) tunnistettiin 27 metaboliittia, jotka erottavat hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset kyhmyt. Erottelevan mallin AUC oli sisäisen validoinnin (n = 104) ja ulkoisen validoinnin (n = 111) ryhmissä vastaavasti 0,915 ja 0,945. Polkuanalyysi paljasti lisääntyneet glykolyyttiset metaboliitit, jotka liittyivät tryptofaanin vähenemiseen keuhkoadenokarsinooman seerumissa verrattuna hyvänlaatuisiin kyhmyihin ja terveisiin verrokkeihin, ja viittasi siihen, että tryptofaanin otto edistää glykolyysiä keuhkosyöpäsoluissa. Tutkimuksemme korostaa seerumin metaboliittibiomarkkereiden arvoa TT:llä havaittujen keuhkokyhmyjen riskin arvioinnissa.
Varhainen diagnoosi on ratkaisevan tärkeää syöpäpotilaiden eloonjäämisasteen parantamiseksi. Yhdysvaltain kansallisen keuhkosyövän seulontatutkimuksen (NLST) ja eurooppalaisen NELSON-tutkimuksen tulokset ovat osoittaneet, että pieniannoksisella tietokonetomografialla (LDCT) tehtävä seulonta voi vähentää merkittävästi keuhkosyöpäkuolleisuutta riskiryhmissä1,2,3. LDCT:n laajamittaisen käytön keuhkosyövän seulonnassa jälkeen oireettomien keuhkokyhmyjen sattumanvaraisten röntgenkuvissa havaittujen löydösten ilmaantuvuus on jatkuvasti lisääntynyt4. Keuhkokyhmyt määritellään halkaisijaltaan enintään 3 cm:n kokoisiksi fokaalisiksi samentumiksi5. Meillä on vaikeuksia arvioida pahanlaatuisuuden todennäköisyyttä ja käsitellä suurta määrää LDCT:ssä sattumanvaraisesti havaittuja keuhkokyhmyjä. TT:n rajoitukset voivat johtaa tiheisiin seurantatutkimuksiin ja vääriin positiivisiin tuloksiin, mikä johtaa tarpeettomiin toimenpiteisiin ja ylihoitoon6. Siksi on tarpeen kehittää luotettavia ja hyödyllisiä biomarkkereita, jotta keuhkosyöpä voidaan tunnistaa oikein varhaisvaiheessa ja erottaa useimmat hyvänlaatuiset kyhmyt alkuperäisessä havaitsemisessa7.
Veren (seerumin, plasman, perifeerisen veren mononukleaarisolujen) kattava molekyylianalyysi, mukaan lukien genomiikka, proteomiikka tai DNA-metylaatio8,9,10, on johtanut kasvavaan kiinnostukseen keuhkosyövän diagnostisten biomarkkereiden löytämiseen. Samaan aikaan metabolomiikkamenetelmät mittaavat solujen lopputuotteita, joihin vaikuttavat endogeeniset ja eksogeeniset toiminnot, ja niitä käytetään siksi taudin puhkeamisen ja lopputuloksen ennustamiseen. Nestekromatografia-tandem-massaspektrometria (LC-MS) on laajalti käytetty menetelmä metabolomiikkatutkimuksissa sen korkean herkkyyden ja laajan dynaamisen alueen ansiosta, joka voi kattaa metaboliitteja, joilla on erilaiset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet11,12,13. Vaikka plasman/seerumin globaalia metabolomiikka-analyysiä on käytetty keuhkosyövän diagnoosiin liittyvien biomarkkereiden tunnistamiseen14,15,16,17 ja hoidon tehokkuuteen,18 seerumin metaboliittien luokittelijat hyvänlaatuisten ja pahanlaatuisten keuhkokyhmyjen erottamiseksi ovat vielä paljon tutkimatta. - massiivinen tutkimus.
Adenokarsinooma ja levyepiteelikarsinooma ovat ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) kaksi päätyyppiä. Useat TT-seulontatestit osoittavat, että adenokarsinooma on yleisin histologinen keuhkosyövän tyyppi1,19,20,21. Tässä tutkimuksessa käytimme ultra-erotuskykyistä nestekromatografiaa-korkean resoluution massaspektrometriaa (UPLC-HRMS) metabolomiikka-analyysiin yhteensä 695 seeruminäytteelle, mukaan lukien terveet verrokit, hyvänlaatuiset keuhkokyhmyt ja TT:llä havaitut ≤3 cm:n pituiset näytteet. Vaiheen I keuhkoadenokarsinooman seulonta. Tunnistimme joukon seerumin metaboliitteja, jotka erottavat keuhkoadenokarsinooman hyvänlaatuisista kyhmyistä ja terveistä verrokeista. Signaalireitin rikastusanalyysi paljasti, että epänormaali tryptofaani- ja glukoosiaineenvaihdunta ovat yleisiä muutoksia keuhkoadenokarsinoomassa verrattuna hyvänlaatuisiin kyhmyihin ja terveisiin verrokkeihin. Lopuksi kehitimme ja validoimme seerumin aineenvaihduntaluokittimen, jolla on korkea spesifisyys ja herkkyys erottaa LDCT:llä havaitut pahanlaatuiset ja hyvänlaatuiset keuhkokyhmyt, mikä voi auttaa varhaisessa erotusdiagnoosissa ja riskinarvioinnissa.
Tässä tutkimuksessa sukupuolen ja iän mukaan sovitetut seeruminäytteet kerättiin retrospektiivisesti 174 terveeltä verrokilta, 292 potilaalta, joilla oli hyvänlaatuisia keuhkokyhmyjä, ja 229 potilaalta, joilla oli vaiheen I keuhkoadenokarsinooma. 695 tutkittavan demografiset tiedot on esitetty lisätaulukossa 1.
Kuten kuvassa 1a on esitetty, Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskuksessa kerättiin yhteensä 480 seeruminäytettä, mukaan lukien 174 terveeltä verrokilta (HC), 170 hyvänlaatuisesta kyhmystä (BN) ja 136 vaiheen I keuhkoadenokarsinoomanäytettä (LA). Löytökohortti kohdentamattomaan metabolomiikkaprofilointiin käyttäen ultra-suorituskykyistä nestekromatografiaa ja korkean resoluution massaspektrometriaa (UPLC-HRMS). Kuten lisäkuvassa 1 on esitetty, LA:n ja HC:n, LA:n ja BN:n väliset erilaiset metaboliitit tunnistettiin luokittelumallin luomiseksi ja erilaisten reittien analyysin tutkimiseksi tarkemmin. Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskuksen keräämille 104 näytteelle ja kahdelle muulle sairaalalle keräämille 111 näytteelle tehtiin sisäinen ja ulkoinen validointi.
a Löytökohortin tutkimuspopulaatio, jolle tehtiin globaali seerumin metabolomiikka-analyysi käyttäen ultra-suorituskykyistä nestekromatografiaa ja korkean resoluution massaspektrometriaa (UPLC-HRMS). b Osittaisen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA) tutkimuskohortin 480 seeruminäytteen kokonaismetabolomista, mukaan lukien terveet kontrollit (HC, n = 174), hyvänlaatuiset kyhmyt (BN, n = 170) ja vaiheen I keuhkoadenokarsinooma (Los Angeles, n = 136). +ESI, positiivinen sähkösuihkutusionisaatiotila, -ESI, negatiivinen sähkösuihkutusionisaatiotila. c–e Metaboliitit, joilla on merkittävästi erilaiset määrät kahdessa annetussa ryhmässä (kaksisuuntainen Wilcoxonin merkittyjen järjestyslukujen testi, väärien löydösten asteikolla korjattu p-arvo, FDR <0,05), on esitetty punaisella (muutoskertaluku > 1,2) ja sinisellä (muutoskertaluku < 0,83). ) näkyvät tulivuorigrafiikassa. f Hierarkkinen klusterointilämpökartta, joka näyttää merkittäviä eroja annotoitujen metaboliittien lukumäärässä LA:n ja BN:n välillä. Lähdetiedot toimitetaan lähdedatatiedostojen muodossa.
Löytöryhmän seerumin kokonaismetabolomi 174 HC, 170 BN ja 136 LA analysoitiin UPLC-HRMS-analyysillä. Osoitamme ensin, että laadunvalvontanäytteet (QC) ryhmittyvät tiiviisti ohjaamattoman pääkomponenttianalyysin (PCA) mallin keskelle, mikä vahvistaa nykyisen tutkimuksen suorituskyvyn vakauden (lisäkuva 2).
Kuten kuvassa 1 b esitetyssä osittaisessa pienimmän neliösumman erotteluanalyysissä (PLS-DA) on esitetty, havaitsimme, että LA:n ja BN:n sekä LA:n ja HC:n välillä oli selkeitä eroja positiivisessa (+ESI) ja negatiivisessa (−ESI) sähkösuihkutusionisaatiotilassa. BN:n ja HC:n välillä ei kuitenkaan havaittu merkittäviä eroja +ESI- ja -ESI-olosuhteissa.
Löysimme 382 erilaista ominaisuutta LA:n ja HC:n välillä, 231 erilaista ominaisuutta LA:n ja BN:n välillä ja 95 erilaista ominaisuutta BN:n ja HC:n välillä (Wilcoxonin merkittyjen järjestyslukujen testi, FDR <0,05 ja monimuutos >1,2 tai <0,83) (kuva 1c-e). . Piikit annotoitiin edelleen (lisädata 3) tietokantaa (mzCloud/HMDB/Chemspider-kirjasto) vasten m/z-arvon, retentioajan ja fragmentoitumismassaspektrihaun avulla (yksityiskohdat on kuvattu menetelmäosiossa)22. Lopuksi tunnistettiin 33 ja 38 annotoitua metaboliittia, joiden runsaudessa oli merkittäviä eroja LA:lle ja BN:lle (kuva 1f ja lisätaulukko 2) sekä LA:lle ja HC:lle (lisäkuva 3 ja lisätaulukko 2). Sitä vastoin BN:ssä ja HC:ssä tunnistettiin vain 3 metaboliittia, joiden runsaudessa oli merkittäviä eroja (lisätaulukko 2), mikä on yhdenmukaista BN:n ja HC:n päällekkäisyyden kanssa PLS-DA:ssa. Nämä erilaiset metaboliitit kattavat laajan kirjon biokemikaaleja (lisäkuva 4). Yhdessä nämä tulokset osoittavat merkittäviä muutoksia seerumin metaboliitissa, jotka heijastavat varhaisvaiheen keuhkosyövän pahanlaatuista transformaatiota verrattuna hyvänlaatuisiin keuhkokyhmyihin tai terveisiin koehenkilöihin. Samaan aikaan BN:n ja HC:n seerumin metaboliitin samankaltaisuus viittaa siihen, että hyvänlaatuisilla keuhkokyhmyillä voi olla monia yhteisiä biologisia ominaisuuksia terveiden yksilöiden kanssa. Koska epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (EGFR) geenimutaatiot ovat yleisiä keuhkoadenokarsinooman alatyypissä 23, pyrimme selvittämään ajurimutaatioiden vaikutusta seerumin metaboliittiin. Sitten analysoimme 72 EGFR-statuksen omaavan tapauksen kokonaismetabolomiprofiilia keuhkoadenokarsinoomaryhmässä. Mielenkiintoista on, että havaitsimme PCA-analyysissä vertailukelpoisia profiileja EGFR-mutaatiopotilaiden (n = 41) ja EGFR-villityypin potilaiden (n = 31) välillä (lisäkuva 5a). Tunnistimme kuitenkin 7 metaboliittia, joiden määrä muuttui merkittävästi EGFR-mutaatiopotilailla verrattuna villityypin EGFR:ää sairastaviin potilaisiin (t-testi, p < 0,05 ja kerrannaisen muutos > 1,2 tai < 0,83) (lisäkuva 5b). Suurin osa näistä metaboliiteista (5/7) on asyylikarnitiineja, joilla on tärkeä rooli rasvahappojen hapettumisreiteissä.
Kuten kuvassa 2a esitetyssä työnkulussa on esitetty, kyhmyjen luokitteluun tarkoitetut biomarkkerit saatiin käyttämällä pienimmän absoluuttisen kutistumisoperaattorin menetelmää ja valintaa, joka perustui 33 differentiaaliseen metaboliittiin, jotka tunnistettiin LA:ssa (n = 136) ja BN:ssä (n = 170). Paras muuttujien yhdistelmä (LASSO) – binäärinen logistinen regressiomalli. Mallin luotettavuutta testattiin kymmenkertaisella ristivalidoinnilla. Muuttujien valintaa ja parametrien regularisointia säädetään uskottavuuden maksimointisakolla parametrilla λ24. Globaali metabolomiikka-analyysi suoritettiin edelleen itsenäisesti sisäisen validoinnin (n = 104) ja ulkoisen validoinnin (n = 111) ryhmissä erottelumallin luokittelukyvyn testaamiseksi. Tuloksena löytöjoukosta tunnistettiin 27 metaboliittia parhaaksi erottelumalliksi, joilla oli suurin keskimääräinen AUC-arvo (kuva 2b), joista 9:llä oli lisääntynyt aktiivisuus ja 18:lla vähentynyt aktiivisuus LA:ssa verrattuna BN:ään (kuva 2c).
Työnkulku keuhkokyhmyluokittelijan rakentamiseksi, mukaan lukien parhaan seerumin metaboliittipaneelin valinta löydösjoukosta käyttämällä binääristä logistista regressiomallia kymmenkertaisen ristivalidoinnin avulla ja ennustavan suorituskyvyn arviointi sisäisissä ja ulkoisissa validointijoukoissa. b LASSO-regressiomallin ristivalidointitilastot metabolisten biomarkkereiden valinnalle. Yllä annetut luvut edustavat valittujen biomarkkereiden keskimääräistä lukumäärää tietyllä λ-arvolla. Punainen katkoviiva edustaa keskimääräistä AUC-arvoa vastaavalla lambda-arvolla. Harmaat virhepalkit edustavat AUC-arvojen minimi- ja maksimiarvoja. Katkoviiva osoittaa parhaan mallin, jossa on 27 valittua biomarkkeria. AUC, ROC-käyrän (ROC) alle jäävä pinta-ala. c 27 valitun metaboliitin kerrannaiset muutokset LA-ryhmässä verrattuna BN-ryhmään löydösryhmässä. Punainen sarake – aktivaatio. Sininen sarake on lasku. d–f ROC-käyrät (Receiver Operating Current Current Current Current Currents), jotka osoittavat erottelevan mallin tehon 27 metaboliittiyhdistelmän perusteella löydös-, sisäisessä ja ulkoisessa validointijoukossa. Lähdetiedot toimitetaan lähdedatatiedostojen muodossa.
Näiden 27 metaboliitin painotettujen regressiokertoimien perusteella luotiin ennustemalli (lisätaulukko 3). Näihin 27 metaboliittiin perustuva ROC-analyysi antoi käyrän alla olevan pinta-alan (AUC) arvoksi 0,933, löytöryhmän herkkyyden 0,868 ja spesifisyyden 0,859 (kuva 2d). Samaan aikaan 38 annotoidusta LA:n ja HC:n välisestä differentiaalisesta metaboliitista 16 metaboliitin joukko saavutti AUC-arvon 0,902, herkkyyden 0,801 ja spesifisyyden 0,856 LA:n erottamisessa HC:stä (lisäkuva 6a-c). Myös differentiaalisten metaboliittien erikertaismuutoskynnyksiin perustuvia AUC-arvoja verrattiin. Havaitsimme, että luokittelumalli toimi parhaiten LA:n ja BN:n (HC) erottamisessa, kun kertausmuutostaso asetettiin arvoon 1,2 verrattuna 1,5:een tai 2,0:aan (lisäkuva 7a, b). 27 metaboliittiryhmään perustuvaa luokittelumallia validoitiin edelleen sisäisissä ja ulkoisissa kohorteissa. Sisäisen validoinnin AUC oli 0,915 (herkkyys 0,867, spesifisyys 0,811) ja ulkoisen validoinnin 0,945 (herkkyys 0,810, spesifisyys 0,979) (kuva 2e, f). Laboratorioiden välisen tehokkuuden arvioimiseksi analysoitiin 40 näytettä ulkoisesta kohortista ulkoisessa laboratoriossa Menetelmät-osiossa kuvatulla tavalla. Luokittelutarkkuuden AUC oli 0,925 (lisäkuva 8). Koska keuhkojen okasolusyöpä (LUSC) on toiseksi yleisin ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) alatyyppi keuhkoadenokarsinooman (LUAD) jälkeen, testasimme myös metaboliaprofiilien validoitua potentiaalista hyödyllisyyttä. BN ja 16 LUSC-tapausta. LUSC:n ja BN:n välisen erottelun AUC oli 0,776 (lisäkuva 9), mikä osoittaa heikompaa kykyä erottaa LUAD:ia ja BN:ää toisistaan.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että kyhmyjen koko TT-kuvissa korreloi positiivisesti pahanlaatuisen kasvaimen todennäköisyyden kanssa ja on edelleen merkittävä kyhmyjen hoidon määräävä tekijä25,26,27. NELSON-seulontatutkimuksen suuren kohortin tietojen analyysi osoitti, että pahanlaatuisen kasvaimen riski alle 5 mm:n imusolmukkeilla oli jopa sama kuin niillä, joilla ei ollut imusolmukkeita28. Siksi säännöllistä TT-seurantaa vaativa vähimmäiskoko on 5 mm, kuten British Thoracic Society (BTS) suosittelee, ja 6 mm, kuten Fleischner Society suosittelee29. Yli 6 mm:n kokoiset kyhmyt, joilla ei ole selviä hyvänlaatuisia piirteitä, joita kutsutaan määrittelemättömiksi keuhkokyhmyiksi (IPN), ovat kuitenkin edelleen merkittävä haaste kliinisessä käytännössä arvioinnissa ja hoidossa30,31. Seuraavaksi tutkimme, vaikuttiko kyhmyjen koko metabolomisiin signatuureihin käyttämällä yhdistettyjä näytteitä löytö- ja sisäisen validoinnin kohorteista. Keskittyen 27 validoituun biomarkkeriin vertasimme ensin alle 6 mm:n HC- ja BN-metabolomien PCA-profiileja. Havaitsimme, että useimmat HC:n ja BN:n datapisteet olivat päällekkäisiä, mikä osoittaa, että seerumin metaboliittitasot olivat samankaltaisia molemmissa ryhmissä (kuva 3a). Ominaisuuskartat eri kokoluokissa pysyivät säilyneinä BN:ssä ja LA:ssa (kuva 3b, c), kun taas pahanlaatuisten ja hyvänlaatuisten kyhmyjen välillä havaittiin ero 6–20 mm:n kokoalueella (kuva 3d). Tämän kohortin AUC oli 0,927, spesifisyys 0,868 ja herkkyys 0,820 6–20 mm:n kokoisten kyhmyjen pahanlaatuisuuden ennustamisessa (kuva 3e, f). Tuloksemme osoittavat, että luokittelija pystyy havaitsemaan varhaisen pahanlaatuisen transformaation aiheuttamat metaboliset muutokset kyhmyn koosta riippumatta.
ad PCA-profiilien vertailu tiettyjen ryhmien välillä perustuen 27 metaboliitin metaboliluokittelijaan. CC ja BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs. BN 6–20 mm. LA:ssa 6–20 mm vs. LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm ja LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e ROC-käyrä, joka näyttää erottelevan mallin suorituskyvyn 6–20 mm:n kokoisille kyhmyille. f Todennäköisyysarvot laskettiin logistisen regressiomallin perusteella 6–20 mm:n kokoisille kyhmyille. Harmaa katkoviiva edustaa optimaalista raja-arvoa (0,455). Yllä olevat luvut edustavat Los Angelesiin ennustettujen tapausten prosenttiosuutta. Käytä kaksisuuntaista Studentin t-testiä. PCA, pääkomponenttianalyysi. AUC-käyrän alla oleva pinta-ala. Lähdetiedot toimitetaan lähdedatatiedostojen muodossa.
Neljä näytettä (iältään 44–61 vuotta), joilla oli samanlaiset keuhkokyhmyjen koot (7–9 mm), valittiin edelleen havainnollistamaan ehdotetun pahanlaatuisuuden ennustusmallin suorituskykyä (kuva 4a, b). Alustavassa seulonnassa tapaus 1 esitettiin kiinteänä kyhmynä, jossa oli kalkkeutumista, mikä liittyy hyvänlaatuisuuteen, kun taas tapaus 2 esitettiin määrittelemättömänä osittain kiinteänä kyhmynä ilman ilmeisiä hyvänlaatuisia piirteitä. Kolme seurantakierrosta TT-kuvauksia osoittivat, että nämä tapaukset pysyivät vakaina neljän vuoden ajan ja niitä pidettiin siksi hyvänlaatuisina kyhmyinä (kuva 4a). Verrattuna sarja-TT-kuvausten kliiniseen arviointiin, kerta-seerumin metaboliittianalyysi nykyisellä luokittelumallilla tunnisti nämä hyvänlaatuiset kyhmyt nopeasti ja oikein todennäköisyysrajoitusten perusteella (taulukko 1). Kuva 4b tapauksessa 3 näyttää kyhmyn, jossa on merkkejä pleuran vetäytymisestä, mikä liittyy useimmiten pahanlaatuisuuteen32. Tapaus 4 esitettiin määrittelemättömänä osittain kiinteänä kyhmynä, jolla ei ollut näyttöä hyvänlaatuisesta syystä. Kaikki nämä tapaukset ennustettiin pahanlaatuisiksi luokittelumallin mukaan (taulukko 1). Keuhkojen adenokarsinooman arviointi osoitettiin histopatologisella tutkimuksella keuhkojen resektioleikkauksen jälkeen (kuva 4b). Ulkoisessa validointijoukossa metabolinen luokittelija ennusti tarkasti kaksi tapausta, joissa epämääräiset, yli 6 mm:n kokoiset keuhkokyhmyt olivat epäselviä (lisäkuva 10).
Kahden hyvänlaatuisen kyhmyn keuhkojen aksiaali-ikkunan TT-kuvat. Tapauksessa 1 neljän vuoden kuluttua tehdyssä TT-kuvauksessa näkyi stabiili, kiinteä kyhmy, jonka koko oli 7 mm, ja kalkkeutumista oikeassa alakulmassa. Tapauksessa 2 viiden vuoden kuluttua tehdyssä TT-kuvauksessa näkyi stabiili, osittain kiinteä kyhmy, jonka halkaisija oli 7 mm oikeassa ylälohkossa. b Kahden vaiheen I adenokarsinooman tapauksen keuhkojen aksiaali-ikkuna-TT-kuvat ja vastaavat patologiset tutkimukset ennen keuhkoresektiota. Tapauksessa 3 näkyi oikeassa ylälohkossa 8 mm halkaisijan kyhmy, jossa oli pleuran retraktio. Tapauksessa 4 näkyi vasemmassa ylälohkossa osittain kiinteä, 9 mm hiomalasikyhmy. Resektoidun keuhkokudoksen hematoksyliini-eosiinivärjäys (H&E) (mittakaavapalkki = 50 μm) osoittaa keuhkoadenokarsinooman asinuskasvukuvion. Nuolet osoittavat TT-kuvissa havaittuja kyhmyjä. H&E-kuvat ovat edustavia kuvia useista (>3) patologin tutkimista mikroskooppisista kentistä.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tuloksemme osoittavat seerumin metaboliittibiomarkkereiden potentiaalisen arvon keuhkokyhmyjen erotusdiagnostiikassa, mikä voi aiheuttaa haasteita TT-seulonnan arvioinnissa.
Validoidun differentiaalisen metaboliittipaneelin perusteella pyrimme tunnistamaan tärkeimpien metabolisten muutosten biologiset korrelaatit. MetaboAnalyst-ohjelmalla tehty KEGG-reitin rikastusanalyysi tunnisti kuusi yhteistä merkittävästi muuttunutta reittiä kahden annetun ryhmän välillä (LA vs. HC ja LA vs. BN, oikaistu p ≤ 0,001, vaikutus > 0,01). Näille muutoksille oli ominaista häiriöt pyruvaatin aineenvaihdunnassa, tryptofaanin aineenvaihdunnassa, niasiinin ja nikotiiniamidin aineenvaihdunnassa, glykolyysissä, TCA-syklissä ja puriinien aineenvaihdunnassa (kuva 5a). Tämän jälkeen suoritimme kohdennettua metabolomiikkaa varmistaaksemme tärkeimmät muutokset absoluuttisella kvantifioinnilla. Yhteisten metaboliittien määritys yleisesti muuttuneissa reiteissä tehtiin kolmoiskvadrupolimassaspektrometrialla (QQQ) käyttäen autenttisia metaboliittistandardeja. Metabolomiikkatutkimuksen kohdenäytteen demografiset ominaisuudet on esitetty lisätaulukossa 4. Yhdenmukaisesti globaalien metabolomiikkatulosten kanssa kvantitatiivinen analyysi vahvisti, että hypoksantiini ja ksantiini, pyruvaatti ja laktaatti olivat lisääntyneet LA:ssa verrattuna BN:ään ja HC:hen (kuva 5b, c, p <0,05). Näissä metaboliiteissa ei kuitenkaan havaittu merkittäviä eroja BN:n ja HC:n välillä.
KEGG-reitin rikastusanalyysi merkitsevästi erilaisista metaboliiteista LA-ryhmässä verrattuna BN- ja HC-ryhmiin. Käytettiin kaksisuuntaista globaalitestiä ja p-arvot säädettiin Holm-Bonferroni-menetelmällä (säädetty p ≤ 0,001 ja vaikutuskoko > 0,01). b–d Violin-diagrammit, jotka esittävät hypoksantiini-, ksantiini-, laktaatti-, pyruvaatti- ja tryptofaanitasoja seerumin HC:ssä, BN:ssä ja LA:ssa LC-MS/MS:llä määritettynä (n = 70 ryhmää kohden). Valkoiset ja mustat katkoviivat osoittavat mediaanin ja kvartiilin. e Violin-diagrammi, joka esittää SLC7A5:n ja QPRT:n normalisoitua Log2TPM (transkriptejä miljoonaa kohti) mRNA-ekspressiota keuhkojen adenokarsinoomassa (n = 513) verrattuna normaaliin keuhkokudokseen (n = 59) LUAD-TCGA-aineistossa. Valkoinen laatikko edustaa kvartiilien välistä aluetta, keskellä oleva vaakasuora musta viiva edustaa mediaania ja laatikosta lähtevä pystysuora musta viiva edustaa 95 %:n luottamusväliä (CI). f Pearsonin korrelaatiokuvaaja SLC7A5:n ja GAPDH:n ilmentymisestä keuhkoadenokarsinoomassa (n = 513) ja normaalissa keuhkokudoksessa (n = 59) TCGA-aineistossa. Harmaa alue edustaa 95 %:n luottamusväliä. r, Pearsonin korrelaatiokerroin. g Normalisoidut solujen tryptofaanitasot A549-soluissa, jotka on transfektoitu epäspesifisellä shRNA-kontrollilla (NC) ja shSLC7A5:llä (Sh1, Sh2), määritettynä LC-MS/MS:llä. Esitetään viiden biologisesti riippumattoman näytteen tilastollinen analyysi kussakin ryhmässä. h NADt:n (kokonais-NAD, mukaan lukien NAD+ ja NADH) solutasot A549-soluissa (NC) ja SLC7A5-knockdown-A549-soluissa (Sh1, Sh2). Esitetään kolmen biologisesti riippumattoman näytteen tilastollinen analyysi kussakin ryhmässä. i A549-solujen glykolyyttinen aktiivisuus ennen SLC7A5:n knockdownia ja sen jälkeen mitattiin solunulkoisella happamoitumisnopeudella (ECAR) (n = 4 biologisesti riippumatonta näytettä ryhmää kohden). 2-DG,2-deoksi-D-glukoosi. Kaksisuuntaista Studentin t-testiä käytettiin kohdissa (b–h). Kohdissa (g–i) virhepalkit edustavat keskiarvoa ± keskihajontaa, jokainen koe suoritettiin kolme kertaa itsenäisesti ja tulokset olivat samankaltaisia. Lähdetiedot toimitetaan lähdedatatiedostojen muodossa.
Koska tryptofaanin aineenvaihdunnan muutokset vaikuttivat merkittävästi LA-ryhmään, arvioimme myös seerumin tryptofaanitasoja HC-, BN- ja LA-ryhmissä QQQ:lla. Havaitsimme, että seerumin tryptofaanipitoisuus oli alhaisempi LA-ryhmissä verrattuna HC- tai BN-ryhmiin (p < 0,001, kuva 5d), mikä on yhdenmukaista aiempien havaintojen kanssa, joiden mukaan verenkierrossa olevat tryptofaanipitoisuudet ovat alhaisemmat keuhkosyöpäpotilailla kuin terveillä kontrolliryhmän henkilöillä33,34,35. Toisessa PET/TT-merkkiainetta 11C-metyyli-L-tryptofaania käyttäneessä tutkimuksessa havaittiin, että tryptofaanisignaalin retentioaika keuhkosyöpäkudoksessa oli merkittävästi pidentynyt verrattuna hyvänlaatuisiin leesioihin tai normaaliin kudokseen36. Oletamme, että tryptofaanin lasku LA-seerumissa saattaa heijastaa aktiivista tryptofaanin ottoa keuhkosyöpäsoluihin.
Tiedetään myös, että tryptofaanin kynureniinireitin lopputuote on NAD+37,38, joka on tärkeä substraatti glyseraldehydi-3-fosfaatin ja 1,3-bisfosfoglyseraatin reaktiolle glykolyysissä39. Aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet tryptofaanin kataboliaan immuunijärjestelmän säätelyssä, mutta tässä tutkimuksessa pyrimme selvittämään tryptofaanin säätelyhäiriöiden ja glykolyysireittien välistä vuorovaikutusta. Liuotettujen aineiden transportteriperheen 7 jäsenen 5 (SLC7A5) tiedetään olevan tryptofaanin transportteri43,44,45. Kinoliinihappofosforibosyylitransferaasi (QPRT) on kynureniinireitin alavirtaan sijaitseva entsyymi, joka muuntaa kinoliinihapon NAMN:ksi46. LUAD TCGA -aineiston tarkastelu paljasti, että sekä SLC7A5:n että QPRT:n ilmentymiset olivat merkittävästi lisääntyneet kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen (kuva 5e). Tämä kasvu havaittiin keuhkojen adenokarsinooman vaiheissa I ja II sekä vaiheissa III ja IV (lisäkuva 11), mikä viittaa tryptofaanin aineenvaihdunnan varhaisiin häiriöihin, jotka liittyvät kasvainten syntyyn.
Lisäksi LUAD-TCGA-aineisto osoitti positiivisen korrelaation SLC7A5:n ja GAPDH-mRNA:n ilmentymisen välillä syöpäpotilaiden näytteissä (r = 0,45, p = 1,55E-26, kuva 5f). Sitä vastoin normaalissa keuhkokudoksessa ei havaittu merkittävää korrelaatiota näiden geenisignatuurien välillä (r = 0,25, p = 0,06, kuva 5f). SLC7A5:n alasajo (lisäkuva 12) A549-soluissa vähensi merkittävästi solujen tryptofaani- ja NAD(H)-tasoja (kuva 5g,h), mikä johti heikentyneeseen glykolyysitoimintaan mitattuna solunulkoisella happamoitumisnopeudella (ECAR) (kuva 1). 5i). Näin ollen seerumin metabolisten muutosten ja in vitro -detektion perusteella oletamme, että tryptofaanin aineenvaihdunta voi tuottaa NAD+:aa kynureniinireitin kautta ja sillä voi olla tärkeä rooli glykolyysin edistämisessä keuhkosyövässä.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että suuri määrä LDCT:llä havaittuja epämääräisiä keuhkokyhmyjä voi johtaa lisäkokeiden, kuten PET-TT:n, keuhkobiopsian ja liikahoidon tarpeeseen väärän positiivisen diagnoosin vuoksi.31 Kuten kuvassa 6 on esitetty, tutkimuksemme tunnisti joukon seerumin metaboliitteja, joilla on potentiaalista diagnostista arvoa ja jotka voivat parantaa riskinarviointia ja myöhempää CT:llä havaittujen keuhkokyhmyjen hoitoa.
Keuhkokohmuja arvioidaan matala-annoksisella tietokonetomografialla (LDTT), jonka kuvantamisominaisuudet viittaavat hyvänlaatuisiin tai pahanlaatuisiin syihin. Kyhmyjen epävarma tulos voi johtaa tiheisiin seurantakäynteihin, tarpeettomiin toimenpiteisiin ja ylihoitoon. Diagnostista arvoa omaavien seerumin aineenvaihduntaluokittelijoiden sisällyttäminen voi parantaa keuhkokyhmyjen riskinarviointia ja myöhempää hoitoa. PET-positroniemissiotomografia.
Yhdysvaltalaisen NLST-tutkimuksen ja eurooppalaisen NELSON-tutkimuksen tiedot viittaavat siihen, että riskiryhmien seulonta matala-annoksisella tietokonetomografialla (LDCT) voi vähentää keuhkosyöpäkuolleisuutta1,3. LDCT:llä havaittujen suurten sattumanvaraisten keuhkokyhmyjen riskinarviointi ja sitä seuraava kliininen hoito ovat kuitenkin edelleen haastavimpia. Päätavoitteena on optimoida olemassa olevien LDCT-pohjaisten protokollien oikea luokittelu sisällyttämällä luotettavia biomarkkereita.
Tiettyjä molekyylibiomarkkereita, kuten veren metaboliitteja, on tunnistettu vertaamalla keuhkosyöpää terveisiin verrokkeihin15,17. Tässä tutkimuksessa keskityimme seerumin metabolomiikka-analyysin soveltamiseen erottaaksemme hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset keuhkokyhmyt, jotka LDCT havaitsee sattumalta. Vertailimme terveiden verrokkien (HC), hyvänlaatuisten keuhkokyhmyjen (BN) ja vaiheen I keuhkoadenokarsinooman (LA) näytteiden globaalia seerumin metabolomia UPLC-HRMS-analyysin avulla. Havaitsimme, että HC:llä ja BN:llä oli samanlaiset metaboliaprofiilit, kun taas LA:ssa havaittiin merkittäviä muutoksia HC:hen ja BN:ään verrattuna. Tunnistimme kaksi seerumin metaboliittiryhmää, jotka erottavat LA:n HC:stä ja BN:stä.
Nykyinen LDCT-pohjainen hyvänlaatuisten ja pahanlaatuisten kyhmyjen tunnistusmenetelmä perustuu pääasiassa kyhmyjen kokoon, tiheyteen, morfologiaan ja kasvunopeuteen ajan kuluessa30. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kyhmyjen koko liittyy läheisesti keuhkosyövän todennäköisyyteen. Jopa korkean riskin potilailla pahanlaatuisuuden riski alle 6 mm:n kyhmyissä on <1 %. Pahanlaatuisuuden riski 6–20 mm:n kokoisille kyhmyille vaihtelee 8 %:sta 64 %:iin30. Siksi Fleischner-seurakunta suosittelee 6 mm:n raja-arvoa rutiininomaisessa TT-seurannassa.29 Yli 6 mm:n kokoisten määrittelemättömien keuhkokyhmyjen (IPN) riskinarviointia ja hoitoa ei kuitenkaan ole tehty riittävästi31. Synnynnäisten sydänvikojen nykyinen hoito perustuu yleensä odottavaan valppauteen ja tiheään TT-seurantaan.
Validoituun metabolomiin perustuen osoitimme ensimmäistä kertaa metabolomisten piirteiden päällekkäisyyden terveiden yksilöiden ja alle 6 mm:n hyvänlaatuisten kyhmyjen välillä. Biologinen samankaltaisuus on yhdenmukainen aiempien TT-havaintojen kanssa, joiden mukaan alle 6 mm:n kyhmyjen pahanlaatuisuuden riski on yhtä pieni kuin koehenkilöillä, joilla ei ole imusolmukkeita.30 On huomattava, että tuloksemme osoittavat myös, että alle 6 mm:n ja ≥6 mm:n hyvänlaatuisilla kyhmyillä on suuri samankaltaisuus metabolomisissa profiileissa, mikä viittaa siihen, että hyvänlaatuisen etiologian toiminnallinen määritelmä on yhdenmukainen kyhmyn koosta riippumatta. Siten nykyaikaiset diagnostiset seerumin metaboliittipaneelit voivat tarjota yhden määrityksen poissulkemistestinä, kun kyhmyt havaitaan alun perin TT:ssä, ja mahdollisesti vähentää sarjaseurantaa. Samaan aikaan sama metabolisten biomarkkereiden paneeli erotti ≥6 mm:n kokoiset pahanlaatuiset kyhmyt hyvänlaatuisista kyhmyistä ja antoi tarkkoja ennusteita samankokoisista ja epäselvistä morfologisista piirteistä omaavista IPN:istä TT-kuvissa. Tämä seerumin metabolian luokittelija toimi hyvin ≥6 mm:n kyhmyjen pahanlaatuisuuden ennustamisessa AUC-arvolla 0,927. Yhteenvetona voidaan todeta, että tuloksemme osoittavat, että ainutlaatuiset seerumin metabolomiset piirteet voivat heijastaa erityisesti kasvaimen aiheuttamia varhaisia aineenvaihduntamuutoksia ja niillä voi olla arvoa riskin ennustajina riippumatta kyhmyjen koosta.
Erityisesti keuhkoadenokarsinooma (LUAD) ja levyepiteelikarsinooma (LUSC) ovat tärkeimmät ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) tyypit. Koska LUSC liittyy vahvasti tupakointiin47 ja LUAD on yleisin TT-seulonnassa havaittujen satunnaisten keuhkokyhmyjen histologia48, luokittelumallimme rakennettiin erityisesti vaiheen I adenokarsinoomanäytteille. Wang ja kollegat keskittyivät myös LUADiin ja tunnistivat yhdeksän lipiditunnistetta lipidomiikkaa käyttäen erottaakseen varhaisvaiheen keuhkosyövän terveistä yksilöistä17. Testasimme nykyistä luokittelumallia 16 vaiheen I LUSC-tapauksella ja 74 hyvänlaatuisella kyhmyllä ja havaitsimme alhaisen LUSC-ennustetarkkuuden (AUC 0,776), mikä viittaa siihen, että LUADilla ja LUSCilla saattaa olla omat metabolomiset tunnisteensa. LUADin ja LUSCin on todellakin osoitettu eroavan etiologian, biologisen alkuperän ja geneettisten poikkeavuuksien suhteen49. Siksi muita histologiatyyppejä tulisi sisällyttää koulutusmalleihin keuhkosyövän väestöpohjaista havaitsemista varten seulontaohjelmissa.
Tässä tutkimuksessa tunnistimme kuusi useimmin muuttunutta reittiä keuhkoadenokarsinoomassa verrattuna terveisiin verrokkeihin ja hyvänlaatuisiin kyhmyihin. Ksantiini ja hypoksantiini ovat puriinimetaboliareitin yleisiä metaboliitteja. Tulostemme mukaisesti puriinimetaboliaan liittyvät välituotteet olivat merkittävästi koholla keuhkoadenokarsinoomaa sairastavien potilaiden seerumissa tai kudoksissa verrattuna terveisiin verrokkeihin tai invasiivista vaihetta edeltävään vaiheeseen15,50. Kohonneet seerumin ksantiini- ja hypoksantiinipitoisuudet saattavat heijastaa nopeasti lisääntyvien syöpäsolujen tarvitsemaa anaboliaa. Glukoosimetabolian säätelyn häiriöt ovat tunnettu syöpämetabolian tunnusmerkki51. Tässä tutkimuksessa havaitsimme merkittävää pyruvaatin ja laktaatin nousua LA-ryhmässä verrattuna HC- ja BN-ryhmään, mikä on yhdenmukaista aiempien raporttien kanssa glykolyyttisten reittien poikkeavuuksista ei-pienisoluista keuhkosyöpää (NSCLC) sairastavien potilaiden ja terveiden verrokkien seerumin metabolomiprofiileissa. Tulokset ovat yhdenmukaisia52,53.
Merkittävää on, että havaitsimme käänteisen korrelaation pyruvaatin ja tryptofaanin aineenvaihdunnan välillä keuhkoadenokarsinoomien seerumissa. Seerumin tryptofaanipitoisuudet olivat alhaisemmat LA-ryhmässä verrattuna HC- tai BN-ryhmään. Mielenkiintoista on, että aiemmassa laajamittaisessa prospektiivista kohorttia käyttäneessä tutkimuksessa havaittiin, että alhaiset tryptofaanipitoisuudet verenkierrossa liittyivät lisääntyneeseen keuhkosyövän riskiin 54. Tryptofaani on välttämätön aminohappo, jonka saamme kokonaan ruoasta. Päädymme siihen, että seerumin tryptofaanin ehtyminen keuhkoadenokarsinoomassa saattaa heijastaa tämän metaboliitin nopeaa ehtymistä. On hyvin tunnettua, että tryptofaanin katabolian lopputuote kynureniinireitin kautta on de novo NAD+ -synteesin lähde. Koska NAD+:aa tuotetaan pääasiassa pelastusreitin kautta, NAD+:n merkitys tryptofaanin aineenvaihdunnassa terveydessä ja sairaudessa on vielä selvittämättä 46. TCGA-tietokannan analyysimme osoitti, että tryptofaanikuljettajan liuenneen aineen kuljettajan 7A5:n (SLC7A5) ilmentyminen oli merkittävästi lisääntynyt keuhkoadenokarsinoomassa verrattuna normaaleihin kontrolleihin ja korreloi positiivisesti glykolyyttisen entsyymin GAPDH:n ilmentymisen kanssa. Aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet pääasiassa tryptofaanin katabolian rooliin kasvaimia vastustavan immuunivasteen tukahduttamisessa40,41,42. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että tryptofaanin oton esto SLC7A5:n estämisellä keuhkosyöpäsoluissa johtaa myöhemmin solujen NAD-tasojen laskuun ja samanaikaiseen glykolyyttisen aktiivisuuden heikkenemiseen. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme tarjoaa biologisen perustan seerumin aineenvaihdunnan muutoksille, jotka liittyvät keuhkoadenokarsinooman pahanlaatuiseen transformaatioon.
EGFR-mutaatiot ovat yleisimpiä ajurimutaatioita ei-pienisoluista keuhkosyöpää (NSCLC) sairastavilla potilailla. Tutkimuksessamme havaitsimme, että EGFR-mutaatiota sairastavilla potilailla (n = 41) oli yleinen metabolomiprofiili, joka oli samanlainen kuin villityypin EGFR:ää sairastavilla potilailla (n = 31), vaikka havaitsimme joidenkin EGFR-mutanttipotilaiden seerumitasojen laskua asyylikarnitiinipotilailla. Asyylikarnitiinien vakiintunut tehtävä on kuljettaa asyyliryhmiä sytoplasmasta mitokondriomatriisiin, mikä johtaa rasvahappojen hapettumiseen energian tuottamiseksi 55. Löydöstemme mukaisesti äskettäisessä tutkimuksessa tunnistettiin myös samanlaisia metabolomiprofiileja EGFR-mutantti- ja EGFR-villityypin kasvainten välillä analysoimalla 102 keuhkoadenokarsinoomakudosnäytteen globaalia metabolomia 50. Mielenkiintoista on, että asyylikarnitiinipitoisuutta havaittiin myös EGFR-mutanttiryhmässä. Siksi on syytä tutkia lisää, heijastavatko asyylikarnitiinitasojen muutokset EGFR:n aiheuttamia metabolisia muutoksia ja taustalla olevia molekyylireittejä.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme luo seerumin aineenvaihduntaluokittimen keuhkokyhmyjen erotusdiagnostiikkaa varten ja ehdottaa työnkulkua, joka voi optimoida riskinarvioinnin ja helpottaa kliinistä hoitoa TT-skannauksen seulonnan perusteella.
Sun Yat-senin yliopistollisen syöpäsairaalan eettinen toimikunta, Sun Yat-senin yliopiston ensimmäinen sairaala ja Zhengzhoun yliopistollisen syöpäsairaalan eettinen toimikunta hyväksyivät tämän tutkimuksen. Löydös- ja sisäisen validoinnin ryhmissä kerättiin 174 seerumia terveiltä henkilöiltä ja 244 seerumia hyvänlaatuisista kyhmyistä henkilöiltä, jotka kävivät vuosittaisissa lääkärintarkastuksissa Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskuksen syövän torjunnan ja ehkäisyn osastolla, sekä 166 hyvänlaatuista kyhmyä. Vaiheen I keuhkoadenokarsinoomat kerättiin Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskuksesta. Ulkoisen validoinnin kohortissa oli 48 hyvänlaatuista kyhmyä, 39 vaiheen I keuhkoadenokarsinoomaa Sun Yat-senin yliopiston ensimmäisestä sairaalasta ja 24 vaiheen I keuhkoadenokarsinoomaa Zhengzhoun syöpäsairaalasta. Sun Yat-senin yliopiston syöpäkeskus keräsi myös 16 vaiheen I levyepiteelisyöpätapausta testatakseen vakiintuneen metabolisen luokittelijan diagnostista kykyä (potilaiden ominaisuudet on esitetty lisätaulukossa 5). Näytteet löydöskohortista ja sisäisen validoinnin kohortista kerättiin tammikuun 2018 ja toukokuun 2020 välisenä aikana. Ulkoisen validoinnin kohortin näytteet kerättiin elokuun 2021 ja lokakuun 2022 välisenä aikana. Sukupuolivääristymän minimoimiseksi kuhunkin kohorttiin kohdistettiin suunnilleen yhtä paljon mies- ja naispuolisia tapauksia. Löytötiimi ja sisäinen arviointitiimi. Osallistujien sukupuoli määritettiin itsearvioinnin perusteella. Kaikilta osallistujilta saatiin tietoinen suostumus, eikä korvausta maksettu. Hyvänlaatuisia kyhmyjä oli tutkittavilla, joilla oli vakaa TT-kuvauspistemäärä 2–5 vuoden kuluttua analyysihetkellä, lukuun ottamatta yhtä tapausta ulkoisesta validointinäytteestä, joka kerättiin preoperatiivisesti ja diagnosoitiin histopatologisesti. Kroonista keuhkoputkentulehdusta lukuun ottamatta. Keuhkoadenokarsinoomatapaukset kerättiin ennen keuhkojen resektiota ja varmistettiin patologisella diagnoosilla. Paastoverinäytteet kerättiin seerumierotusputkiin ilman antikoagulantteja. Verinäytteitä hyytytettiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja sentrifugoitiin sitten 2851 × g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa seerumin supernatantin keräämiseksi. Seeruminäytteet pakastettiin -80 °C:seen metaboliitin uuttamiseen asti. Sun Yat-sen -yliopiston syöpäkeskuksen syövän ehkäisyn ja lääketieteellisen tutkimuksen osasto keräsi seeruminäytteen 100 terveeltä luovuttajalta, mukaan lukien yhtä suuri määrä 40–55-vuotiaita miehiä ja naisia. Kunkin luovuttajan näytettä sekoitettiin yhtä suuret tilavuudet, ja tuloksena oleva näytteenotto jaettiin erihin ja säilytettiin -80 °C:ssa. Seerumiseosta käytettiin vertailumateriaalina laadunvalvonnassa ja tietojen standardoinnissa.
Vertailu- ja testinäytteet sulatettiin ja metaboliitit uutettiin yhdistetyllä uuttomenetelmällä (MTBE/metanoli/vesi) 56. Lyhyesti sanottuna 50 μl seerumia sekoitettiin 225 μl:aan jääkylmää metanolia ja 750 μl:aan jääkylmää metyyli-tert-butyylieetteriä (MTBE). Sekoita seosta ja inkuboi jäillä 1 tunnin ajan. Sitten näytteet sekoitettiin ja vorteksoitiin 188 μl:n kanssa MS-laatuista vettä, joka sisälsi sisäisiä standardeja (13C-laktaatti, 13C3-pyruvaatti, 13C-metioniini ja 13C6-isoleusiini, ostettu Cambridge Isotope Laboratoriesilta). Seos sentrifugoitiin sitten 15 000 × g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa, ja alempi faasi siirrettiin kahteen putkeen (125 μl kumpaankin) LC-MS-analyysiä varten positiivisessa ja negatiivisessa tilassa. Lopuksi näyte haihdutettiin kuiviin nopeassa tyhjiökonsentraattorissa.
Kuivatut metaboliitit liuotettiin 120 μl:aan 80-prosenttista asetonitriiliä, vorteksoitiin 5 minuuttia ja sentrifugoitiin 15 000 × g:n voimalla 10 minuuttia 4 °C:ssa. Supernatantit siirrettiin meripihkanvärisiin lasipulloihin, joissa oli mikroinsertit, metabolomiikkatutkimuksia varten. Kohdentamaton metabolomiikka-analyysi tehtiin ultra-suorituskykyisen nestekromatografian ja korkean resoluution massaspektrometrian (UPLC-HRMS) avulla. Metaboliitit eroteltiin käyttämällä Dionex Ultimate 3000 UPLC -järjestelmää ja ACQUITY BEH Amide -kolonnia (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Positiivisessa ionitilassa liikkuvat faasit olivat 95 % (A) ja 50 % asetonitriiliä (B), joista kumpikin sisälsi 10 mmol/l ammoniumasetaattia ja 0,1 % muurahaishappoa. Negatiivisessa tilassa liikkuvat faasit A ja B sisälsivät vastaavasti 95 % ja 50 % asetonitriiliä, molemmat faasit sisälsivät 10 mmol/l ammoniumasetaattia, pH = 9. Gradienttiohjelma oli seuraava: 0–0,5 min, 2 % B:tä; 0,5–12 min, 2–50 % B:tä; 12–14 min, 50–98 % B:tä; 14–16 min, 98 % B:tä; 16–16,1 min, 98–2 % B:tä; 16,1–20 min, 2 % B:tä. Kolonnin lämpötila pidettiin 40 °C:ssa ja näytteen lämpötila 10 °C:ssa automaattisessa näytteenottimessa. Virtausnopeus oli 0,3 ml/min ja injektointitilavuus oli 3 μl. Q-Exactive Orbitrap -massaspektrometriä (Thermo Fisher Scientific), jossa oli sähkösuihkutusionisaatiolähde (ESI), käytettiin täyden skannauksen tilassa ja kytkettynä ddMS2-monitorointitilaan suurten tietomäärien keräämiseksi. MS-parametrit asetettiin seuraavasti: ruiskutusjännite +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillaarilämpötila 320 °C, suojakaasu 40 arb, apukaasu 10 arb, anturin lämmittimen lämpötila 350 °C, skannausalue 70–1050 m/h, resoluutio 70 000. Tiedot hankittiin Xcalibur 4.1 -laitteella (Thermo Fisher Scientific).
Tiedon laadun arvioimiseksi yhdistetyt laadunvalvontanäytteet (QC) luotiin ottamalla 10 μl:n näytteet supernatantista kustakin näytteestä. Kuusi laadunvalvontanäyteinjektiota analysoitiin analyyttisen sekvenssin alussa UPLC-MS-järjestelmän stabiilisuuden arvioimiseksi. Laadunvalvontanäytteet lisätään sitten erään säännöllisesti. Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt 11 seeruminäyte-erää analysoitiin LC-MS:llä. 100 terveen luovuttajan seerumipooliseoksen alikvootteja käytettiin vertailumateriaalina kussakin erissä uuttoprosessin seurantaan ja eräkohtaisten vaikutusten säätämiseen. Löytökohortin, sisäisen validointikohortin ja ulkoisen validointikohortin kohdentamaton metabolomiikka-analyysi suoritettiin Sun Yat-senin yliopiston metabolomiikkakeskuksessa. Guangdongin teknillisen yliopiston analyysi- ja testauskeskuksen ulkoinen laboratorio analysoi myös 40 näytettä ulkoisesta kohortista luokittelumallin suorituskyvyn testaamiseksi.
Uuttamisen ja uudelleenliuottamisen jälkeen seerumin metaboliittien absoluuttinen kvantifiointi mitattiin ultra-korkean suorituskyvyn nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (Agilent 6495 triple quadrupole) käyttäen sähkösuihkutusionaatiolähdettä (ESI) monireaktioseurantatilassa (MRM). Metaboliittien erottamiseen käytettiin ACQUITY BEH Amide -kolonnia (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Liikkuva faasi koostui 90 % (A) ja 5 % asetonitriilistä (B) sekä 10 mmol/l ammoniumasetaattia ja 0,1 % ammoniakkiliuosta. Gradienttiohjelma oli seuraava: 0–1,5 min, 0 % B; 1,5–6,5 min, 0–15 % B; 6,5–8 min, 15 % B; 8–8,5 min, 15 %–0 % B; 8,5–11,5 min, 0 % B. Kolonni pidettiin 40 °C:ssa ja näyte 10 °C:ssa automaattisessa näytteenottimessa. Virtausnopeus oli 0,3 ml/min ja injektiotilavuus oli 1 μl. MS-parametrit asetettiin seuraavasti: kapillaarijännite ±3,5 kV, sumutinpaine 35 psi, suojakaasun virtaus 12 l/min, suojakaasun lämpötila 350 °C, kuivauskaasun lämpötila 250 °C ja kuivauskaasun virtaus 14 l/min. Tryptofaanin, pyruvaatin, laktaatin, hypoksantiinin ja ksantiinin MRM-konversiot olivat 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 ja 151,0–107,9. Tiedot kerättiin käyttämällä Mass Hunter B.07.00 -ohjelmistoa (Agilent Technologies). Seeruminäytteiden tryptofaanin, pyruvaatin, laktaatin, hypoksantiini ja ksantiini kvantifioitiin käyttämällä standardiliuosseosten kalibrointikäyriä. Solunäytteiden tryptofaanipitoisuus normalisoitiin sisäisen standardin ja soluproteiinimassan suhteen.
Huippujen uutto (m/z ja retentioaika (RT)) suoritettiin käyttämällä Compound Discovery 3.1- ja TraceFinder 4.0 -ohjelmia (Thermo Fisher Scientific). Erien välisten mahdollisten erojen poistamiseksi jokainen testinäytteen ominaispiiki jaettiin saman erän vertailumateriaalin ominaispiikillä suhteellisen runsauden saamiseksi. Sisäisten standardien suhteelliset keskihajonnat ennen standardointia ja sen jälkeen on esitetty lisätaulukossa 6. Kahden ryhmän välisiä eroja karakterisoitiin virheellisten löydösten määrällä (FDR < 0,05, Wilcoxonin merkittyjen järjestyslukujen testi) ja kerrannaisen muutoksella (> 1,2 tai < 0,83). Uutettujen ominaisuuksien raaka-MS-tiedot ja vertailuseerumilla korjatut MS-tiedot on esitetty vastaavasti lisätiedoissa 1 ja 2. Huippujen annotointi suoritettiin neljän määritellyn tunnistustason perusteella, mukaan lukien tunnistetut metaboliitit, oletettavasti annotoidut yhdisteet, oletettavasti karakterisoidut yhdisteluokat ja tuntemattomat yhdisteet22. Compound Discovery 3.1:ssä (mzCloud, HMDB, Chemspider) tehtyjen tietokantahakujen perusteella biologiset yhdisteet, joilla oli MS/MS-vastaavat validoituja standardeja tai täsmälleen oikeat vastineet mzCloudissa (pistemäärä > 85) tai Chemspiderissa, valittiin lopulta välituotteiksi differentiaalisen metabolomin välille. Kunkin ominaisuuden huippuannotaatiot sisältyvät lisätietoihin 3. MetaboAnalyst 5.0 -ohjelmistoa käytettiin summa-normalisoidun metaboliittien runsauden yksimuuttuja-analyysiin. MetaboAnalyst 5.0 arvioi myös KEGG-reitin rikastusanalyysiä merkittävästi erilaisten metaboliittien perusteella. Pääkomponenttianalyysi (PCA) ja osittaisen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA) analysoitiin käyttämällä ropls-ohjelmistopakettia (v.1.26.4) pinon normalisoinnilla ja automaattisella skaalauksella. Optimaalinen metaboliittibiomarkkerimalli kyhmyjen pahanlaatuisuuden ennustamiseksi luotiin käyttämällä binääristä logistista regressiota, jossa oli pienin absoluuttinen kutistus ja valintaoperaattori (LASSO, R-paketti v.4.1-3). Erotinmallin suorituskykyä havaitsemis- ja validointijoukoissa karakterisoitiin arvioimalla AUC ROC-analyysin perusteella pROC-paketin (v.1.18.0.) mukaisesti. Optimaalinen todennäköisyysraja-arvo saatiin mallin maksimi-Youden-indeksin (herkkyys + spesifisyys – 1) perusteella. Näytteet, joiden arvot ovat kynnysarvoa pienempiä tai suurempia, ennustetaan vastaavasti hyvänlaatuisiksi kyhmyiksi ja keuhkoadenokarsinoomaksi.
A549-soluja (#CCL-185, American Type Culture Collection) kasvatettiin F-12K-elatusaineessa, joka sisälsi 10 % FBS:ää. SLC7A5:een kohdistuvat lyhyet hiusneula-RNA-sekvenssit (shRNA) ja ei-kohdistava kontrolli (NC) insertoitiin lentivirusvektoriin pLKO.1-puro. shSLC7A5:n antisense-sekvenssit ovat seuraavat: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5:n (#5347) ja tubuliinin (#2148) vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technologylta. SLC7A5:n ja tubuliinin vasta-aineita käytettiin laimennoksena 1:1000 Western blot -analyysissä.
Seahorse XF -glykolyyttinen stressitesti mittaa solunulkoisen happamoitumisen (ECAR) tasoja. Määrityksessä glukoosia, oligomysiini A:ta ja 2-DG:tä annettiin peräkkäin solujen glykolyyttisen kapasiteetin testaamiseksi ECAR:lla mitattuna.
Kohdentamattomalla kontrollilla (NC) ja shSLC7A5:llä (Sh1, Sh2) transfektoidut A549-solut levitettiin yön yli 10 cm:n halkaisijaltaan oleville maljoille. Solujen metaboliitit uutettiin 1 ml:lla jääkylmää 80-prosenttista metanolia. Metanoliliuoksessa olevat solut kaavittiin pois, kerättiin uuteen putkeen ja sentrifugoitiin 15 000 × g:llä 15 minuuttia 4 °C:ssa. Kerättiin 800 µl supernatanttia ja kuivattiin käyttämällä nopeaa tyhjiökonsentraattoria. Kuivattujen metaboliittipellettien tryptofaanipitoisuudet analysoitiin sitten LC-MS/MS:llä edellä kuvatulla tavalla. A549-solujen (NC ja shSLC7A5) solujen NAD(H)-pitoisuudet mitattiin kvantitatiivisella NAD+/NADH-kolorimetripakkauksella (#K337, BioVision) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kunkin näytteen proteiinipitoisuudet mitattiin metaboliittien määrän normalisoimiseksi.
Otoskoon alustavaan määrittämiseen ei käytetty tilastollisia menetelmiä. Aikaisempia biomarkkereiden löytämiseen tähtääviä metabolomiikkatutkimuksia15,18 on pidetty koon määrittämisen vertailukohtina, ja näihin raportteihin verrattuna otos oli riittävä. Tutkimuskohortista ei suljettu pois yhtään näytettä. Seeruminäytteet jaettiin satunnaisesti etsintäryhmään (306 tapausta, 74,6 %) ja sisäisen validoinnin ryhmään (104 tapausta, 25,4 %) kohdentamattomia metabolomiikkatutkimuksia varten. Valitsimme myös satunnaisesti 70 tapausta kustakin ryhmästä etsintäjoukosta kohdennettuja metabolomiikkatutkimuksia varten. Tutkijat eivät tienneet ryhmittelystä LC-MS-tiedonkeruun ja -analyysin aikana. Metabolomiikkatietojen ja solukokeiden tilastolliset analyysit on kuvattu vastaavissa Tulokset-, Kuvaselitteet- ja Menetelmät-osioissa. Solujen tryptofaanin, NADT:n ja glykolyyttisen aktiivisuuden kvantifiointi suoritettiin kolme kertaa itsenäisesti identtisillä tuloksilla.
Lisätietoja tutkimusasetelmasta on tähän artikkeliin liittyvässä Natural Portfolio Report Abstractissa.
Uutettujen ominaisuuksien raaka MS-data ja referenssiseerumin normalisoitu MS-data on esitetty vastaavasti lisätiedoissa 1 ja lisätiedoissa 2. Differentiaalisten ominaisuuksien huippumerkinnät on esitetty lisätiedoissa 3. LUAD TCGA -datajoukko voidaan ladata osoitteesta https://portal.gdc.cancer.gov/. Graafin piirtämiseen tarvittavat syöttötiedot on annettu lähdetiedoissa. Lähdetiedot ovat tämän artikkelin mukaisia.
Kansallinen keuhkoseulontatutkimusryhmä ym. Keuhkosyöpäkuolleisuuden vähentäminen matala-annoksisella tietokonetomografialla. Pohjois-Englanti. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ja Prophet, PC. Keuhkosyövän seulonta matala-annoksisella helikaalisen tietokonetomografian avulla: tuloksia National Lung Screening Study (NLST) -tutkimuksesta. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, ym. Keuhkosyöpäkuolleisuuden vähentäminen volumetrisella TT-seulonnalla satunnaistetussa tutkimuksessa. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Julkaisun aika: 18.9.2023